抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并进行鉴定。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心法对猪HEV进行纯化,免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选能稳定分泌抗HEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗进行生物学鉴定。结果筛选出4株能稳定分泌抗HEV单抗的杂交瘤细胞株2H2、2A1、1E2、4D4。经鉴定,4株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水抗HEV的ELISA效价可达1∶12800～1∶51200,其中3株HI效价可达1∶24～1∶28,另1株为0。4株杂交瘤细胞分泌的单抗与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;杂交瘤细胞染色体数为83～103;除2A1单抗为IgG2b外,其他3株均为IgG1;Westernblot分析表明,2H2、2A1和4D4能识别HEV的血凝素-酯酶蛋白(HE),1E2可识别纤突蛋白(S)。结论已成功制备出抗HEV的单克隆抗体,为HEV快速检测试剂的研制奠定了基础。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体。方法以人ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化,筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株,并对McAb进行纯化。用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类,Western blot鉴定其抗原特异性,细胞黏附试验检测其中和活性。结果筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2,杂交瘤染色体众数为98~104。纯化后的单抗蛋白浓度为1.253 mg/ml,纯度达83.6%,效价可达2.56×105。其分泌的抗体亚型为IgG1,腹水效价达5.12×105,可与ICAM-1特异性结合,可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附,具有明显的中和ICAM-1的活性。结论已成功制备出抗ICAM-1的McAb,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

具有中和活性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备具有中和活性抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体。方法　采用杂交瘤技术制备单克隆抗体 ,并以ELISA结合免疫组化技术进行筛选。结果　获得 8株分泌抗呼吸道合胞病毒的特异性单克隆抗体的细胞株 ,其中 2株分泌的单抗具有中和活性 ,效价 1∶16 0和 1∶32 0。结论　成功制备出具有中和活性的呼吸道合胞病毒的单抗     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定。方法以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株。对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验。与细菌培养法对比检测208份临床标本。结果6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38×107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应。6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%。结论制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂。     

抗人类共激活蛋白单克隆抗体的制备

目的制备抗人类共激活蛋白(CLP)单克隆抗体,并进行纯化。方法配制2×DMEM培养基,与等量的2.2%甲基纤维素溶液混合,加入HAT、胎牛血清等,配成半固体HAT选择性细胞培养基。用基因重组人CLP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS-2细胞融合后,直接在半固体培养基上克隆化培养,筛选可持续、稳定、高效分泌抗CLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对分泌的单抗进行鉴定后,制备小鼠腹水,经DEAE离子交换柱纯化,半饱和硫酸铵沉淀,G25凝胶过滤除盐。结果共筛选出14株分泌抗CLP单抗的杂交瘤细胞,其培养上清可与相对分子质量约16000的CLP抗原结合,抗体类型为鼠IgGa1型。多数克隆分泌的抗体相对亲和力大于1∶20000,14株克隆分泌的单抗分别对应3个抗原结合位点。纯化后的单抗纯度接近95%。结论已成功制备并纯化了抗人CLP单克隆抗体,为建立CLP免疫学检测方法奠定了基础。