膀胱癌患者外周血树突状细胞的体外培养扩增和鉴定

目的研究膀胱癌患者外周血树突状细胞(DC)的体外培养扩增和鉴定。方法应用Ficoll-Hypaque离心获得界面细胞,贴壁培养2h,获得单个核细胞,体外以重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,50ng/ml)+重组人白细胞介素4(rhlL-4,10ng/ml)+人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α,50ng/ml)诱导培养。倒置相差显微镜及扫描电镜下观察DC生长情况；流式细胞仪检测DC表型；MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞BIU87的杀伤率。结果第6天体外培养的DC由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,第8天为形态不规则的毛刺状,为典型DC形态。流式细胞仪检测表明,成熟DC高水平表达CD_(1a)、CD_(83)、CD_(86)及HLA-DR等。被DC激活的T细胞对膀胱癌细胞株BIU87的杀伤率为(48.8±3.7)%,未经DC激活的T细胞的杀伤率为(25.7±1.5)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论膀胱癌患者外周血经rhGM-CSF+rhIL-4+hTNF-α体外诱导培养能诱导出DC。     

转人白细胞介素2基因人膀胱癌细胞株的建立及体外生物学特性

探讨转基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用逆转录病毒载体Ｚｉｐ／ｈＩＬ－２将ｈＩＬ－２基因导入人膀胱癌细胞系ＥＪ细胞中，在体外建立了具有分泌ｈＩＬ－２活性的细胞株ＥＪ／ＩＬ－２。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实ｈＩＬ－２基因已整合到ＥＪ／ＩＬ－２基因组中。流式细胞仪行细胞ＤＮＡ周期分析表明ｈＩＬ－２基因的导入及表达对ＥＪ细胞的增殖无影响。免疫荧光检测发现ｈＩＬ－２基因的导入及表达不能促进ＥＪ细胞表面ＨＬＡ抗原的表达。放射线灭活后ＥＪ／ＩＬ－２细胞丧失增殖能力，但仍能维持一定水平的ｈＩＬ－２分泌活性达２周左右。从而为制备灭活的转基因瘤苗提供了初步经验。     

逆转录病毒载体介导的HyTK基因在人膀胱癌细胞株EJ中的表达

为探索ＨＳＶ１ＴＫ基因对人膀胱癌的治疗作用，作者用一种与潮霉素磷酸转移酶（ｈｐｔ）基因相融和的Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１ＴＫ）基因（简称ＨｙＴＫ基因）作目的基因，用逆转录病毒载体将ＨｙＴＫ基因导入人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞中表达。含ＨｙＴＫ基因的逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫＮ，经包装细胞ＰＡ３１７包装后，获得重组逆转录病毒；病毒感染人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞，经潮霉素Ｂ筛选培养，获得潮霉素Ｂ的抗性克隆；ＰＣＲ扩增证实：病毒感染的ＥＪ细胞中导入了ＨＳＶ１ＴＫ基因，为开展ＨｙＴＫ基因治疗膀胱癌打下了基础。     

链亲和素标记的GM-CSF治疗膀胱癌疗效的初步观察

目的：将链亲和素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的口行性和有效性.方法：选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM-CSF组、SA-GFP组和SA-GM-CSF组,分别给予相应治疗 6次治疗后,SA-GM-CSF组和组5（对照组）接受第二次肿瘤细胞攻击 观察所有小鼠的一般情况、肿瘤情况和生存期,并对死亡小鼠进行解剖,留取器官组织做病理切片或免疫组织化学染色.结果：SA-GM-CSF组与其它各组比较,肿瘤出现的时间晚,肿瘤生长速度慢,小鼠生存期长（Pmax=0.023,P＜0.05） MB49细胞二次攻击后,SA-GM-CSF组与对照组相比,生存期差异有显著统计学意义（X2=9.551,P=0.002）.结论：SA-GM-CSF原位锚定于雌性C57BL/6成瘤小鼠膀胱黏膜,有效抑制了膀胱肿瘤的生长,延长了小鼠的生存时间,并且能抵抗同源肿瘤的再次攻击,提示可能诱导了小鼠针对MB49的免疫保护作用 SA-GM-CSF原位锚定治疗比单纯细胞因子灌注法疗效更好.     

转基因肝星状细胞株的建立及生物学特性

目的　建立稳定表达肝细胞生长因子 (HGF)的肝星状细胞株CFSC/HGF。方法　构建携带hgf基因全长序列的重组逆转录病毒pMSCV HGF ,反复感染肝星状细胞系CFSC建立转基因肝星状细胞株。对建立的CFSC/HGF用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )和酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别从基因和蛋白水平进行鉴定 ,并通过免疫细胞化学检测、细胞增殖活性测定 ,以及对人肝癌细胞HepG2的扩散试验等对其生物学特性进行初步研究。结果　构建了重组逆转录病毒质粒 pMSCV HGF及包装细胞株PT/HGF ,建立并筛选出HGF表达水平分别为0 .15、2 .2 3、5 .48、9.76μg/L的 4个细胞株CFSC/HGF ,细胞表达结蛋白和α 平滑肌肌动蛋白 ;随HGF表达水平不同 ,CFSC/HGF细胞增殖活性显示出明显的差别 ;CFSC/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,生长受抑。结论　建立了稳定表达hHGF的肝星状细胞株CFSC/HGF ,并对其生物学行为进行了初步鉴定。     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导培养及功能分析

目的:建立小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)体外培养和扩增方法,为以DCs为靶点的免疫治疗研究提供基础。方法:从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中提取骨髓细胞,以含重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,400U/ml)和IL-4(200U/ml)的RPMI 1640(含10%FBS)进行诱导培养,于培养第4天加入脂多糖(LPS)继续培养2d。利用倒置相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞生长状态和超微结构,流式细胞术鉴定培养第6天时DCs纯度及免疫表型,流式细胞微球捕获芯片技术检测第2、4、6天培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)、干扰素-1(IFN-1)、TNF-α、IL-12p70含量。结果:重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓细胞4d,加入脂多糖(LPS)继续培养2d,近90%细胞高表达DCs特征性标志物CD11c,高表达抗原提呈分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86、CD80,具有典型的树突状形态学特征和分泌炎症性细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和IL-12p70的功能。结论:小鼠骨髓细胞以重组小鼠GM-CSF和IL-4体外诱导培养的DCs具有较高的纯度,保持了体内的形态学、免疫表型及功能特征。     

大鼠未成熟树突状细胞体外扩增及功能鉴定

摘要：目的 探讨建立大鼠体外大量扩增未成熟树突状细胞(DC) 的方法, 以及不同剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)对大鼠DC分化成熟的影响。方法 分离纯化并扩增大鼠骨髓细胞，用不同剂量GM CSF培养,6 d 和10 d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T 淋巴细胞增殖的情况。结果 小剂量GM CSF 培养获得的DC(GMlowDC) 形态上具有DC 的典型特征,在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性,具有DC 的典型特征,细胞表面高表达CD11c,低表达CD80，CD86及MHC II类分子,与大剂量GM CSF加IL 4的联合组培养获得的DC( GMhighDC) 相比,其体外刺激未致敏T 淋巴细胞的增殖能力较弱.结论 笔者所建立的培养未成熟DC 的方法是可行的；GM CSF的剂量与细胞的成熟程度相关。     

转人白细胞介素-12基因膀胱癌瘤苗的抗肿瘤作用

目的 制备人白细胞介素—12(hIL-l2)转基因膀胱癌瘤苗，观察其特异性抗肿瘤免疫作用。方法 经逆转录病毒载体将hIL—12编码基因导入膀胱癌细胞株MBT—2中，用聚合酶链反应(PCR)技术检测目的基因是否整合入MBT—2基因组中，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测hIL—12活性，将转基因细胞接种到36只荷瘤小鼠，检测细胞毒T细胞杀伤活性。结果 hIL—12 cDNA经逆转录病毒载体导入MTT—2细胞中后，hIL—12基因已完整、稳定地整合到MBT—2基因组中，使MBT—2细胞具有分泌hIL—12活性，每24h达32．8mol/L以上。转基因细胞接种荷瘤小鼠后，可见瘤体变小(P＜0．01)，细胞毒T细胞杀伤活性增强。结论 转hIL—12基因瘤苗，能够诱导小鼠的特异性抗肿瘤免疫反应。     

CD基因联合GM-CSF基因对胰腺癌治疗作用的实验研究

目的：观察自杀基因CD联合GM—CSF基因的抗胰腺癌作用。方法：应用逆转录病毒方法转导CD和GM—CSF基因。皮下接种胰腺癌细胞TD2，肿瘤局部注射重组表达的pVITR02-CD-GM—CSF，然后连续10d给予5-氟胞嘧啶（5-Fc）300mg／kg治疗，观察肿瘤的生长情况。结果：CD／5-Fc联合GM—CSF治疗后，小鼠肿瘤体积显著缩小，存活期明显延长，与对照组以及GM—CSF组和CD／5-Fc组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01），且肿瘤瘤体内CD8^＋细胞浸润增加，MHC—Ⅰ和B7—1表达明显增加。结论：CD基因联合细胞因子基因GM—CSF可增强CD的抗肿瘤作用，其疗效要好于GM—CSF或CD基因单独治疗。     

人骨髓长时间培养中破骨细胞的形成

在粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）存在下，离体培养人骨髓单个核细胞３周，结果显示有大量具破骨细胞特性的多核细胞形成，细胞核３～２０余个不等，多数细胞显示抗酒石酸盐酸性磷酸酶强阳性反应，当与牙本质片共育３周，可在牙本质片上形成典型吸收陷窝，并可见具有破骨细胞形态样的细胞，提示此培养条件下有大量破骨细胞形成．     

siRNA端粒酶催化亚单位诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

目的：研究siRNA（small interference RNA）对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和端粒酶催化亚单位（hTERT）基因表达的影响。方法：设计并体外转录合成针对hTERT基因的3个特异性siRNA,通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞,分别采用MTT和DNA原位末端标记（TUNEL）法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率（IR％）和凋亡指数（A100）的影响,半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western Blotting检测siRNA对hTERT mRNA及其蛋白表达的影响。结果：转染后的siRNA 1～3组的B1U-87细胞的IR（34．62％、62．19％、57．43％）和AI（30．62％、54．26％、51．50％）均分别显著高于正常对照组（3．46％和5．03％）（均P〈0．05）,hTERT mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组;其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和hTERT表达的抑制作用均显著高于siRNA1。结论：体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞hTERT的表达,诱导BIU-87细胞凋亡,从而抑制BIU-87细胞生长,为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。     

Cytokine Gene Modification of Bladder Cancer Cells for the Establishment of Bladder Cancer Vaccine

A bladder tumor vaccine in mouse models was established by introducing interleukin–2 (IL–2) gene into mouse bladder cancer cells (MBT–2). Mice injected with non–modified MBT–2 cells did not reject subsequent challenge of MBT–2 cells. Mice injected with IL–2–gene–modified MBT–2 cells (MBT–2/IL–2) rejected subsequent challenge of unmodified MBT–2 cells but not 38C13 cells, which have the same genetic background but different antigenicity. According to these results, an injection of MBT–2/II.–2 can establish specific immunity against parental MBT–2 cells in mice, which is also demonstrated by cytotoxic T lymphocytes assay. Vaccinations with MBT–2/IL–2 cured 60% of bladder cancer which had been pre–established in mice. These results suggest that tumor cells genetically modified with IL–2 gene can act as a tumor vaccine which is expected to be a new method for immunotherapy of cancers.     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对膀胱癌T24细胞杀伤作用的研究

目的：体外观察塞来昔布对人膀胱癌T24细胞株的抑制作用,并探讨其可能的机制。方法i采用MTT法检测塞来昔布对T24细胞的生长抑制作用;采用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态;采用Western印迹法检测塞来昔布作用前后T24细胞COX-2蛋白的表达变化;采用RT—PCR法检测塞来昔布作用前后T24细胞Bcl-2及Bax基因的表达变化。结果：塞来昔布（≥100μmol／L）作用24h及48h后能明显抑制T24细胞的生长并诱导凋亡;塞来昔布100μmol／L作用,24h及48h后,T24细胞COX-2蛋白表达量下降,Bcl-2基因表达亦下调,而Bax基因在塞来昔布作用24h后变化不明显,48h后表达上调。结论：塞来昔布能抑制T24细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调Bcl-2、上调Bax基因表达有关。     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.     

沉默 Notch-1 基因影响人膀胱癌 RT4 细胞生物学行为的体外实验研究

目的：研究沉默 Notch-1 基因对人膀胱癌 RT4 细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化等生物学行为的影响。方法： 设计并构建 Notch-1 shRNA,选取 RT4 细胞作为研究对象分别进行转染。实验细胞分为 Notch-1 阴性对照组（shRNA NC）, Notch-1 干扰组（Notch-1 shRNA）。细胞转染 48 h 后,MTT 法检测细胞增殖水平变化;Transwell 检测细胞侵袭力的改变;流式细胞术检测细胞凋亡水平情况;RT-PCR 和 Western blot 检测凋亡相关蛋白（Bax、Bid、Bcl-2）及上皮间充质转化（EMT） 因子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）在 mRNA 和蛋白水平上的改变。结果：与 shRNA NC 组相比,Notch-1 shRNA 组细胞增殖率明显下降（t =4.629,P =0.010）,侵袭力减弱（t = 8.193,P=0.001）,细胞凋亡率明显升高（t= –18.441,P<0.001）,Bad（t = –12.521,P<0.001 ;t = –6.983,P =0.002）、Bid（t = –9.231,P<0.001 ;t= –8.871,P=0.001）、E-cadherin（t= –13.457,P<0.001 ;t= –5.610,P=0.005）mRNA 和蛋白表达量增多,Bcl2（t=10.651,P<0.001 ;t=6.973,P=0.002）、N-cadherin（t=6.505,P<0.001 ;t=10.132,P=0.001）、Vimentin（t=9.135,P<0.001 ;t =5.630,P =0.005）mRNA 和蛋白表达量显著降低。结论：沉默 Notch-1 的表达能够抑制人膀胱癌 RT4 细胞的增殖和侵袭迁移,促进其细胞凋亡,其机制可能与诱导 Bad、Bid、E-cadherin,抑制 Bcl2、N-cadherin、Vimentin 的表达有关。     

塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24体外增殖和凋亡的影响

目的：研究选择性环氧化酶2（Cox-2）抑制剂塞来昔布对人膀胱肿瘤细胞株T24体外增殖和凋亡的影响。方法：常规培养的贴壁生长的T24细胞,分别与不同浓度塞来昔布、POE2等共培养,MTT法测定塞来昔布及PGE。对T24细胞增殖活性的影响,流式细胞仪测定塞来昔布及PGEz处理后T24细胞的凋亡率;建立细胞悬浮培养体系,将悬浮生长的T24细胞,分别与塞来昔布、PGE。等共培养,流式细胞仪测定塞来昔布及PGE2处理后T24细胞的凋亡率（失巢凋亡率）。结果：塞来昔布呈剂量依赖性地显著抑制贴壁生长的T24细胞的增殖、增加其凋亡,而PGE2和对贴壁生长的T24细胞增殖和凋亡无明显影响;塞来昔布显著增加而PGE2显著抑制T24的失巢凋亡。结论：选择性Cox-2抑制剂塞来昔布可显著抑制T24细胞的生长,诱导贴壁及悬浮生长状态的T24细胞产生凋亡,其可能机制之一是逆转了Cox-2产物PGE2对T24细胞的抗凋亡保护作用,包括对抗肿瘤药物及脱壁诱导的细胞凋亡的抑制作用。     

从膀胱癌患者分离并培养人膀胱平滑肌细胞

目的：建立从膀胱癌患者的分离并培养膀胱平滑肌细胞的实验技术.方法：取一小块无明显肿瘤生长的膀胱组织,分离并培养膀胱平滑肌细胞;动态观察细胞形态变化、生长增殖情况以及平滑肌肌动蛋白（SMA）、结蛋白（Desmin）和广谱细胞角蛋白（AE1/AE3）的表达.结果：接种24 h后即有长梭形细胞贴壁生长,10天后长至80%融合,呈典型的＂峰谷＂样形态;传代后1天为潜伏期,2～6天为指数生长期,然后进入融合平台期,需再次传代.第2代细胞的SMA和Desmin表达阳性率分别高达（99.0±0.8）%和（97.0±2.1）%,不表达AE1/AE3.随着传代次数的增加,细胞去分化,细胞形态变成短梭状或椭圆形;SMA和Desmin的表达开始下降,传至第5代时,SMA和Desmin阳性率分别降至（78.0±3.3）%和（74.0±2.6）%;至第7代时,SMA和Desmin阳性率降至（51.0±3.0）%和（49.0±2.6）%.第7代细胞经血清饥饿培养48 h后,细胞又能再分化,形态转变成长梭状,SMA和Desmin阳性率可分别升至（90.0±3.5）%和（88.0±2.5）%,具有显著性差异.结论：本研究所培养的人膀胱平滑肌细胞具有较高的纯度,血清饥饿能促进去分化的细胞再分化,能为构建组织工程膀胱提供种子细胞.     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。