Aurora A反义寡核苷酸对人肺癌细胞系A549细胞生长与细胞周期的影响

目的：探讨Aurora A基因表达的下调对肺癌细胞生长和细胞周期分布的影响。方法：用脂质体瞬时转染法介导Aurora A反义硫代磷酸寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）处理肺腺癌A549细胞,RT-PCR及Western-blot方法检测Aurora A mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期分布的变化,四氮唑盐法（MTT）检测转染前后细胞生长抑制率变化。结果：Aurora A反义寡核苷酸作用于A549细胞后,细胞的生长抑制率在一定范围内呈剂量和时间依赖性,其中48h的IC50值约为300nmol/L,在此浓度和时间下,Aurora A反义寡核苷酸可明显降低Aurora A mRNA和蛋白的表达,且细胞周期阻滞于G2/M期和S期。结论：下调Aurora A表达可抑制肺腺癌细胞系A549的增殖,同时导致细胞阻滞于G2/M期及S期。     

cFLIP反义寡核苷酸对人肺腺癌SPCA-1细胞作用的探讨

目的:研究脂质体介导的反义寡核苷酸cFLIP对人肺腺癌细胞系SPCA-1凋亡的影响,探讨反义技术选择性封闭目的基因表达进而发挥抗肿瘤作用的机制.方法:用脂质体lipofectamineTM2000将反义寡核苷酸cFLIP(Lipo-ASODN)和无义寡核苷酸cFLIP(Lipo-NASODN)片断导入人肺腺癌细胞系SPCA-1,通过MTT法分别检测细胞生长情况;应用RT-PCR检测cFLIP基因表达,并用Western Blot检测cFLIP蛋白表达,同时原位末端标记(TUNEL)和流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:MTT实验显示浓度为0.5μmol/L时Lipo-ASODN组细胞生长曲线逐渐降低,24h细胞抑制率可达71.52%,显著高于Lipo-NASODN组和Liposome对照组(P＜0.01);转染24h后LipoASODN组RT-PCR可见cFLIP基因表达量明显少于对照组(P＜0.01),Western Blot可见cFLIPS蛋白表达呈下降趋势,但cFLIPL变化不明显;TUNEL检测可见反义寡核苷酸组细胞核内出现阳性染色,流式细胞仪检测可见明显凋亡峰,且其作用呈一定的剂量依赖性.结论:反义寡核苷酸转染SPCA-1细胞后,cFLIPL/S基因与蛋白表达显著下调,表明此途径是cFLIPL/S mRNA基因片段诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一.     

反义寡核苷酸治疗肿瘤

反义寡核苷酸（ASODN）治疗肿瘤具有特异性高、副作用少的特点，与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用，并已逐渐从实验室走向临床。现综述目前反义寡核苷酸治疗肿瘤所选择的靶点及其疗效。     

VEGF反义寡核苷酸对Lewis肺癌细胞的抑制作用

目的:〖HT5"SS〗 探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）反义寡核苷酸对C57BL/6小鼠肺癌细胞的抑制作用。〖HT5W〗方法:〖HT5"SS〗 制作C57BL/6小鼠皮下肺癌模型40只,分为VEGF反义寡核苷酸（ASODN）治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组、VEGF错义寡核苷酸（MODN）治疗组及对照组。接种Lewis肺癌细胞后24 h内,用ASODN、SODN及MODN皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,观察小鼠肿瘤的生长情况以及组织形态学改变,标本常规石蜡切片,HE染色,用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达。〖HT5W〗结果:〖HT5"SS〗 对照组、ASODN组、SODN组、MODN组平均瘤重分别为（7.33±0.71）g、（4.56±0.38）g、(7.59±0.32)g和（7.62±0.39）g,ASODN组、SODN组、MODN组抑瘤率分别为43.8%、5.5%、3.1%。光镜下观察, VEGFASODN 能明显抑制肿瘤细胞生长,降低增殖活性。 免疫组化结果表明,ASODN组VEGF的表达水平明显低于SODN组、MODN组及对照组（P<0.05）。CD34免疫组化结果表明,ASODN组MVD为8.25±2.12,与对照组(14.78±3.51)、SODN组(13.71±3.62)及MODN组(12.81±2.56)比较,ASODN组MVD明显减少（P<0.01）。〖HT5W〗结论: 〖HT5"SS〗原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长。     

反义端粒酶PNA对肺癌细胞株生长的体外抑制作用

目的　探讨反义端粒酶肽核酸 (PNA)片段对肺癌细胞株端粒酶活性及细胞株生长的抑制作用。方法　将人工合成的端粒酶反义PNA片段 ,应用脂质体转染法将反义端粒酶序列导入肺腺癌细胞株A5 49及小细胞癌细胞株NCI H44 6中 ,采用MTT法检测活细胞数 ,采用RT PCR ELLISA法检测端粒酶活性。结果　转染 72h后 ,A5 49、NCI H 44 6细胞株端粒酶活性 (A45 0值 )分别由 0 .5 82± 0 .0 3 9和 0 .5 71± 0 .0 43降低至 0 .2 94± 0 .0 48(P <0 .0 1)和 0 .2 76± 0 .0 5 1(P <0 .0 1) ;而两细胞株的活细胞数 (A5 80值 )分别由 0 .485± 0 .0 0 9和 0 .5 13± 0 .0 15降低至 0 .191± 0 .0 2 7(P <0 .0 1)和 0 .13 8± 0 .0 46(P <0 .0 1) ,细胞生长受到显著抑制。结论　反义端粒酶PNA片段具有抑制肺癌细胞株端粒酶活性的作用 ,并可抑制肺癌细胞的生长     

反义寡核苷酸治疗肿瘤

反义寡核苷酸(ASODN)治疗肿瘤具有特异性高、副作用少的特点,与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用,并已逐渐从实验室走向临床。现综述目前反义寡核苷酸治疗肿瘤所选择的靶点及其疗效。     

bFGF反义寡核苷酸对肺癌细胞凋亡的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）反义寡核苷酸对肺癌细胞凋亡的影响。方法：以脂质体作为转染载体,转染bFGF反义寡核苷酸于SH-77细胞,用Western blot方法检测bFGF蛋白的表达,用流式细胞仪检测SH-77细胞凋亡率。结果：与随机对照序列组相比,bFGF反义寡核苷酸对SH-77细胞中bFGF蛋白表达有明显抑制作用,P〈0．05;可使SH-77细胞凋亡率明显增加,P％0．01。结论：bFGF在肺癌细胞凋亡中有重要调节作用,可作为肺癌增敏治疗的有效靶点。     

端粒酶正义及反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响

背景与目的:近年研究表明,端粒及端粒酶与肿瘤发生密切相关。端粒酶反义寡核苷酸直接作用于端粒酶或诱导肿瘤细胞分化均可使端粒酶活性下降,抑制肿瘤生长。而用端粒酶反义寡核苷酸直接抑制端粒酶活性是否可引起肿瘤细胞再分化,尚不清楚。由于端粒DNA重复序列是以端粒酶RNA为模板合成的,因此端粒DNA可以和端粒酶正义寡核苷酸互补结合。这种结合是否也能影响肿瘤细胞的生长,值得研究。本研究正是要探讨端粒酶正义及反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的作用。方法:脂质体介导正、反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测细胞角蛋白表达,同时观察细胞形态学变化。结果:端粒酶正义寡核苷酸与反义寡核苷酸一样可抑制CNE1和CNE2Z细胞的生长,且呈剂量和时间依赖性。1.5、3.0、4.5、6.0μmol/L正义寡核苷酸处理CNE1细胞,6h抑制率分别为16.28%、19.38%、22.48%和23.26%,48h分别达26.26%、38.89%、39.90%和38.89%;CNE2Z细胞6h抑制率分别为7.69%、8.24%、18.13%和20.32%,48h分别为28.84%、28.88%、32.89%和31.54%。正、反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达显著增加(P<0.01),细胞形态趋向分化成熟。结论:端粒酶正、反义寡核苷酸均可抑制鼻咽癌细胞的生长,并促进细胞分化。     

肝细胞癌差异表达基因P-02反义寡核苷酸抑瘤作用的体外实验研究

目的：通过全硫代修饰的肝细胞癌差异表达基因P-02反义寡核苷酸对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖活性的影响，探讨P-02基因的功能。方法：以脂质体为载体，采用MTT法、RT-PCR、流式细胞术检测P-02 AS-ODN(antisense oligonucleotide)对SMMC-7721细胞生长、增殖、细胞周期的作用。结果：脂质体介导的P-02基因反义寡核苷酸可抑制SMMC-7721增殖，RT-PCR结果显示P-02基因的扩增条带明显减弱，流式细胞术显示G1期细胞增多，M期及S期细胞数减少。结论：脂质体介导的AS-ODN可抑制SMMC-7721的恶性表型，证实P-02基因在肝细胞癌的发生发展中可能有重要作用。     

Tiam 1表达下调对胃癌细胞骨架及裸鼠体内成瘤转移影响的观察

目的:观察T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam 1)反义寡核苷酸(ASODN)转染对胃癌细胞骨架及裸鼠体内成瘤转移能力的影响。方法:采用层粘连蛋白黏附法,由胃癌MKN-45细胞株中筛选获得高侵袭转移亚株(MH)。以脂质体介导将Tiam1ASODN转染至MH细胞中,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及定量细胞ELISA技术分别检测Tiam 1 mRNA和蛋白的表达。采用细胞骨架蛋白染色及裸鼠接种法分别观察Tiam1ASODN转染后MH细胞在骨架结构和裸鼠体内成瘤转移能力方面的变化。结果:应用0.43μmol/LTiam 1 ASODN转染可特异性抑制胃癌MH细胞中Tiam 1 mRNA和蛋白表达(0.162±0.018,0.982±0.119),与脂质体转染组(0.789±0.054,1.237±0.108)、正义寡核苷酸(SODN)-脂质体转染组(0.754±0.039,1.234±0.103)、未转染组(0.801±0.065,1.290±0.182)相比,分别为后3者的20.2%～21.5%、76.1%～79.6%(P=0.000、0.037)。同时ASODN转染组细胞在裸鼠体内的肺转移率25%(2/8)也较未转染组88%(7/8)、正义寡核苷酸组75%(6/8)显著下降(P=0.039),且其胞膜表面突起及伪足变稀疏或缩短、骨架结构紊乱程度减轻。结论:特异性ASODN转染可有效抑制Tiam 1在胃癌细胞中的表达并削弱其体内侵袭转移能力,这可能是通过调整胃癌细胞骨架结构重组,降低其变形、游走能力而实现的。     

硫代修饰脂质体包裹反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的影响

目的：探讨硫代修饰脂质体包裹的反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的抑制作用。方法：40只C57BL／6小鼠右腋皮下接种Lewis肺癌细胞后，随机分为4组：VEGF反义寡核苷酸组（ASODN）、VEGF正义寡核苷酸组（SODN）、VEGF错义寡核苷酸组（MODN）及对照组。接种24h内，4组小鼠分别皮下注射经脂质体包裹的ASODN、SODN及MODN进行治疗，对照组只注射脂质体，每周2次，连续4周。观察各组小鼠肿瘤的生长情况，超声检测肿瘤血管的收缩期峰值速度（Ps）及阻力指数（砌），原位杂交法及RT—PCR法对肿瘤内VEGFmRNA表达水平进行检测。结果：ASODN组小鼠肿瘤生长受到显著抑制，PS、RI与其它各组相比有明显差异（P〈0．01），VEGF mRNA表达水平亦有明显降低。结论：硫代反义VEGF寡核苷酸能明显抑制肺癌血流，从而抑制肿瘤生长。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响。方法:设计并合成HPSE特异性ASODN(HPSE-ASODN),脂质体介导转染A549细胞。West-ern blotting检测A549细胞中HPSE蛋白的表达。黏附实验和侵袭实验检测HPSE-ASODN对A549细胞黏附和侵袭的影响,Hoecht 3222染色法检测HPSE-ASODN对A549细胞凋亡的影响。结果:与对照组和脂质体组相比,HPSE-ASODN转染下调A549细胞中HPSE蛋白的表达,且显著抑制A549细胞的黏附和侵袭(P<0.01);HPSE-ASODN转染可诱导A549细胞凋亡,凋亡率明显高于未转染组和脂质体组[(44.7±18.9)%vs(1.2±3.3)%、(5.8±20.1)%,P<0.01]。结论:HPSE-ASODN能下调肺癌A549细胞中HPSE蛋白的表达,抑制A549细胞的黏附和侵袭,诱导其凋亡。     

反应停、紫杉醇对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用

目的　研究反应停、小剂量紫杉醇对 L ewis肺癌小鼠皮下移植瘤和肺转移瘤的抑制作用 ,并探讨其与肿瘤细胞凋亡和细胞周期的关系。方法　 50只荷 L ewis肺癌小鼠随机分为四组 ,分别给予生理盐水、反应停、小剂量紫杉醇、反应停联合小剂量紫杉醇治疗 ,第 2 1天处死动物 ,称取鼠重、瘤重、肺重 ,计数肺转移结节数 ,免疫组化染色记数肿瘤组织微血管密度 ,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率及细胞周期。结果　反应停、小剂量紫杉醇单独及联合治疗组肿瘤重量与对照组间差异无显著性 (P>0 .0 5)。反应停、小剂量紫杉醇单独及联合治疗组肺重、肺转移结节数及肿瘤组织微血管密度均小于对照组 ,差异有显著性 (P<0 .0 5)。各治疗组肿瘤细胞凋亡率及 G1、S、G2 期肿瘤细胞百分数与对照组间差异无显著性 (P>0 .0 5)。结论　反应停、小剂量紫杉醇不能抑制 L ewis肺癌皮下移植瘤生长 ,但可抑制肿瘤肺转移 ,两药间无协同或拮抗作用。反应停、小剂量紫杉醇不诱导 L ewis肺癌细胞凋亡 ,不影响肿瘤细胞生长周期     

Survivin反义寡核苷酸树形分子载体的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:研究聚酰胺(polyamidoamine,PAMAM)树形分子高聚合物作为survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligodeoxynucleotide,survivin-asODN)载体传递系统的可行性以及对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法:将200μg/Lsurvivin-asODN和3.66μg/L PAMAM混合制备PAMAM反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照。透射电镜观察复合物的形态、粒径,Zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的包封率、载药率和体外DNA释放速度。将上述两种基因载体复合物转染肝癌SMMC-7721细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达;流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率。结果:成功制备PAMAM反义基因载体系统PAMAM-survivin-asODN。该复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径[(64.9±9.60)vs(193.9±32.20)nm,P<0.01],但zeta电位高于后者[(37.7±3.80)vs(22.6±2.20)mV,P<0.05];两者基因载药率、包封率无显著差异;PAMAM反义基因复合物对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d。PAMAM-survivin-asODN转染肝癌细胞的效果强于脂质体-survivin-asODN(P<0.05)。转染后肝癌细胞siurvivin蛋白的表达显著低于脂质体复合物[(26.80±5.65)vs(36.96±5.89),P<0.05],该细胞的凋亡率显著高于脂质体复合物转染细胞[(60.3±8.25)%vs(48.7±9.39)%,P<0.05]。结论:PAMAM作为载体系统能将survivin-asODN高效递送到肝癌SMMC-7221细胞,诱导人肝癌细胞的凋亡。     

紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞作用的研究

目的:观察紫杉醇对3种不同p53基因型肺癌细胞的作用。方法:以不同浓度紫杉醇(0.1、1.0、10、100、1 000nmol/L)分别作用肺癌细胞A549、H322、H1299不同时间(4、12、24、48、96 h),实验同时设阴性对照组(不加紫杉醇)和空白对照组(只加细胞培养液)。采用MTT、流式细胞术、Western blotting检测细胞的生长及细胞周期、凋亡、乙酰化微管蛋白、p53蛋白等指标变化。结果:紫杉醇对3株肺癌细胞的生长抑制作用均随着作用时间的延长而增强(P0.05);不同浓度紫杉醇对3株细胞生长的影响也存在差异(P0.05)。3株细胞中A549细胞半数抑制浓度相对较低,但3株细胞间对紫杉醇敏感性的差异无统计学意义(P0.05)。紫杉醇10 nmol/L作用时,3株细胞G2/M期变化趋势基本一致,1 000 nmol/L作用时,A549细胞G2/M期比例与作用时间呈正相关(P0.05),H322和H1299的G2/M细胞于24 h达高峰,作用后期H1299出现异常多倍体;同浓度紫杉醇作用的各株肺癌细胞的凋亡呈时间依赖性,但1 000 nmol/L组诱导的细胞凋亡比10 nmol/L组更晚出现。浓度依赖性实验中,10 nmol/L诱导凋亡比例最高;紫杉醇浓度≤100 nmol/L时,G2/M期比例随浓度增加而增高(P0.05);紫杉醇浓度≥100 nmol/L时,各肺癌细胞株G2/M期比例间的差异无统计学意义。凋亡和G2/M期阻滞无相关性(P0.05)。紫杉醇作用后,A549细胞p53蛋白呈浓度和时间依赖性增加,H322细胞p53蛋白无明显变化。3株细胞乙酰化微管蛋白均较对照组显著上升(P0.05)。结论:紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞生长的抑制作用呈时间依赖性。紫杉醇可增加野生型p53蛋白表达,诱导p53依赖和非p53依赖的两种凋亡途径,p53基因型影响了高浓度紫杉醇对肺癌细胞的周期阻滞作用,但对紫杉醇化疗敏感性无显著影响。     

Cyclin D1反义寡核苷酸对SGC7901胃癌细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究Cyclin D1反义寡核苷酸对胃癌细胞SGC7901生长和化疗敏感性的影响，并探讨其内在机制。方法 采用脂质体lipoiect AMINE2000包裹硫代修饰的Cyclin D1 ASODN转染细胞，观察对SGC7901细胞的量效曲线及其生长曲线。0．2μmol／L Cyclin D1 ASODN转染细胞24小时后，给予梯度浓度的5—氟尿嘧啶(5—FU)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(DDP)，观察量效反应，计算IC50。应用RT—PCR检测细胞转染后24小时和48小时时Cyclin D1、胸苷酸合成酶(TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶(TP)、二氢叶酸还原酶(DHFR) mRNA表达情况。结果 Cyclin D1 ASODN对SGC7901细胞产生剂量依赖性的抑制效应，0．2μmol／L Cyclin D1 ASODN转染24小时能显著抑制胃癌细胞生长，降低Cyclin D1 mRNA表达。Cyclin D1 ASODN增加了胃癌细胞对5—FU，MTX，DDP的敏感性，ASODN 化疗组对各化疗药物的IC50均有显著下降。RT—PCR显示Cyclin D1 ASODN转染后24小时时TS、DHFR mRNA表达较对照组下降，而TPmRNA表达较对照组升高，48小时时TS、TP、DHFR mRNA表达的改变更加明显。结论 Cyclin D1 ASODN能降低Cyclin D1 mRNA表达，抑制胃癌细胞SGC7901的生长，并通过改变5—FU，MTX代谢相关酶的表达提高细胞对它们的敏感性。     

A phase II study of oxaliplatin and paclitaxel in patients with advanced non-small-cell lung cancer.

PURPOSE: To evaluate the efficacy and toxicity of oxaliplatin and paclitaxel as first-line therapy for patients with advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC). PATIENTS AND METHODS: The treatment regimen was given as defined in a phase I investigation in patients with previously treated ovarian cancer. It consisted of paclitaxel 175 mg/m(2) (1-h infusion) and oxaliplatin 130 mg/m(2) (2-h infusion) given every 21 days. Eligible patients had stage IIIB (pleural effusion)/IV NSCLC, measurable disease, no prior chemotherapy, Eastern Cooperative Oncology Group performance status 0-2, and adequate hematological, renal and hepatic function. RESULTS: A total of 38 patients were enrolled with the following characteristics: 29% male (n = 11); 71% female (n = 27); median age 64.5 years (range 37-78); performance status of 0-1 84% (n = 32); stage IIIB 8% (n = 3); stage IV 92% (n = 35). One hundred and eighty-one cycles were administered, with a median of four per patient (range one to 12). The overall objective response rate for all 38 patients was 34.2% [95% confidence interval (CI) 19.6% to 51.4%]. This response rate includes 13 patients who met criteria for a partial response. No complete responses were observed. Median overall survival time was 9.2 months (95% CI 6-12.4) and median progression-free survival time was 4.3 months (95% CI 2.1-6.5). The 1- and 2-year overall survival rates were 37% and 21%, respectively. Hematological toxicity included six patients with grade 4 neutropenia. Non-hematological toxicity consisted mainly of grades 1 and 2 neurosensory toxicity. Laryngodysesthesia was observed in two patients following oxaliplatin infusion. No grade 4 non-hematological toxicities were encountered. CONCLUSION: This regimen is well tolerated, and demonstrates activity in patients with advanced NSCLC.