基于mCherry荧光蛋白的植物基因过表达遗传转化系统的初步研究

过量表达是植物基因功能鉴定和农作物遗传改良的重要途径。为了提高转基因植株的研究效率,以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建了由玉米泛素启动子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列组成过量表达框的转基因载体。分别将4个水稻类受体激酶的编码序列插入表达框,通过农杆菌介导转化水稻品种泰粳394。转基因植株T1种子的m Cherry荧光检测结果表明,平均62.5%的T1株系呈3∶1分离。根据实时定量RT-PCR分析结果,过表达阳性植株的目的基因相对表达量显著高于阴性植株和未转化的泰粳394。运用该载体系统,能够进行转基因后代大规模筛选,获得目的基因过量表达的转基因株系,从而促进植物基因功能研究和转基因应用研究。     

抑制水稻WRKY10基因表达的分析

在水稻T-DNA插入突变体库中发现一个生长缓慢的突变体Osdg,其T-DNA插入位点侧翼序列编码一个WRKY类转录因子(OsWRKY10)。为了明确插入位点的基因是否为引起突变表型的基因,构建了抑制OsWRKY10基因表达的dsRNA干涉载体并转化水稻(Oryza sativa L.subsp.japonica,中花11),获得转基因植株(WInW)。T1代转基因植株的表型观测结果表明,部分WInW干涉植株出现生育期延长、株高下降、分蘖数减少、穗长缩短等表型,与突变体Osdg的突变表型相似,这说明,抑制OsWRKY10基因的表达可能延缓水稻的生长发育,该基因与引起Osdg突变表型的基因具有相似功能。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

Xα21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体，经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因Xα21导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系SWR20中，共获得43个独立的转基因株系，100余株转基因水稻植株，经GUS活性，潮霉素抗性检测及PCR分析表明，外源基因已整合到转基因水稻基因组中，白叶枯病原菌接种试验表明，大部分T0代转基因水稻植株的抗病性有明显提高，多数植株抗或高,抗，个别为感病，经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后，GUS瞬间表达率可高达 92．5％，稳定转化频率达到27．6％。α     

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L~(-1) KT、0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.05 mg·L~(-1) NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L~(-1)的IBA的SM1(无其他生长素)的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L~(-1) CuSO4显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T0代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

水稻OsCERK2转基因后代的鉴定与分析

为了研究水稻Os CERK2基因的功能,构建了Os CERK2基因过表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株,经多代筛选和分子检测,获得了4个超量表达的过表达纯系和2个转录水平下降的RNAi纯系。转基因植株经病原微生物细胞壁成分喷雾处理,采用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中病程相关(PR)基因的表达情况,结果发现,诱导后过表达植株中PR基因表达增强,而RNAi植株中表达下降;抗病性鉴定结果表明,过表达转基因植株对白叶枯菌致病小种PXO99的抗性增强,而RNAi植株与野生型差异不显著。结果表明,过量表达Os CERK2基因可能是水稻抗病的有效途径。     

OsCtBP-A基因过量表达和RNAi沉默对水稻根系生长和抗性的影响

为了阐明己克隆的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的功能,构建了该基因的过量表达和RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴愈伤组织,分别获得了45个过量表达和75个RNAi 沉默T0代转基因植株,并进行了PCR和GUS染色鉴定。T1代过量表达株OsCtBP-A基因表达量明显增加,苗期根系生长增加,对水稻白叶枯病抗性无明显变化;而基因沉默株OsCtBP-A基因表达量显著下降,苗期根系发育迟缓,抗旱性明显降低,抗病性减弱。表明OsCtBP-A基因的表达可能对水稻苗期根系发育、抗旱性和抗病性具有不同程度的调控作用。     

CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

RNA干涉水稻端粒酶再生植株的初步研究

依据水稻端粒酶基因的相关生物学信息,构建了含有水稻端粒酶序列RNA干扰结构的植物表达载体pC am 23A-1-2,并利用农杆菌介导法将目的基因导入到粳稻品种日本晴中,获得了78个独立转化子,共165棵转基因植株。通过PCR和Southern杂交分析,证明RNA干扰结构已整合进水稻基因组中;应用染色体末端限制性片段分析法,显示在转基因水稻中端粒DNA序列长度有逐代缩短的趋势,初步证明这些转基因水稻中端粒酶亚基已失活,但是T0和T1代转基因水稻植株的主要农艺性状没有发生明显变化。     

一个水稻茎叶优势表达锌指基因启动子的克隆及功能分析

通过RT-PCR分析,鉴定了一个在水稻茎、叶中特异表达的锌指基因OsZF153.利用PCR扩增了OsZF153基因上游约2 kb启动子区,构建了启动子与GUS的融合表达载体pCZF153P-GUS.pCZF153P-GUS转基因T0植株GUS活性分析显示:转基因植株的根、茎、叶、颖壳中检测到GUS活性,其中茎和叶GUS表达活性较强,而根和颖壳表达较弱,在雄蕊和雌蕊及种子不同发育阶段中没有检测到GUS活性,表明OsZF153启动子是一个水稻非生殖器官表达,且在茎、叶中优势表达的启动子.     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。