基于红外光谱结合化学计量学的青叶胆及其近缘种亲缘关系研究

目的 傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）结合化学计量学分析青叶胆及其同属近缘种的亲缘关系,为青叶胆药用植物资源的开发利用提供理论依据。方法 采集青叶胆及近缘种共39份样品的红外光谱信息,对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、二阶求导等预处理,结合化学计量学分析光谱数据。结果 青叶胆及其近缘种红外光谱主要吸收区域为900~400、1 310~900、1 500~1 310、1 800~1 500、2 800~3 000、3 000~3 500 cm^-1附近。二阶导数图谱在400~1 000 cm^-1指纹区吸收峰差异明显,物种之间吸收峰的峰数、峰强、峰形差异较大。对预处理后的红外光谱数据进行主成分分析（PCA）以及偏最小二乘判别分析（PLS-DA）发现,6种獐牙菜的PCA分析优于PLS-DA分析,系统聚类分析表明青叶胆与圈纹獐牙菜、显脉獐牙菜亲缘关系较近。结论 FTIR结合化学计量学方法,能够快速鉴别不同种类獐牙菜属植物,明确青叶胆及其近缘种之间的亲缘关系,为獐牙菜属植物亲缘关系研究提供一种快速、有效的方法。     

红外光谱法快速预测不同种类重楼中重楼皂苷含量

重楼皂苷是中药重楼主要的有效成分,为了快速评价重楼品质,保证重楼在临床治疗中的疗效,本文采用红外光谱结合偏最小二乘回归法(partial least squares regression,PLSR)对重楼中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ进行定量分析,建立快速评价重楼品质的方法。采集78份不同产区、不同种类重楼样品的红外光谱,用高效液相色谱测定重楼样品中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ及重楼皂苷Ⅶ的含量,将重楼的红外光谱数据和液相数据进行拟合,快速预测3种重楼皂苷含量。原始红外光谱经多元散射校正(multiplicative signal correction,MSC)、标准正态变量(standard normal variate,SNV)、正交信号校正(orthogonal signal correction,OSC)、一阶求导(first derivative,1st Der)、二阶求导(second derivative,2nd Der)预处理后,运用偏最小二乘回归分析建立重楼皂苷的定量预测模型。重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的最佳预处理方法为MSC+OSC+2nd Der,重楼皂苷Ⅶ的最佳预处理方法为MSC+SNV+OSC+2nd Der;重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ3个指标成分定量校正模型的决定系数(R~2)分别为0.930 8,0.934 8,0.912 3 mg·g~(-1);校正均方根误差(root mean square error of estimation,RMSEE)分别为1.855 0,0.632 3,0.001 6 mg·g~(-1);验证模型的决定系数(R~2)分别为0.948 8,0.963 6,0.780 1 mg·g~(-1);预测均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)分别为1.704 6,1.227 7,0.001 9 mg·g~(-1);定量模型的预测值与真实值比较接近,模型预测效果好,其中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ定量模型效果优于重楼皂苷Ⅶ。该方法无损、快速、准确,可用于重楼中重楼皂苷含量的快速测定。     

基于形态和红外光谱分析的云南重楼及近似种的快速鉴别

目的基于形态和红外光谱法建立云南重楼及近似种的鉴别方法,并进一步分析其亲缘关系,为资源开发利用提供依据。方法对云南重楼及其近似种进行了原植物形态比较,并对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、二阶求导等预处理,采用主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partialleastsquares discriminantanalysis,PLS-DA)及系统聚类分析(hierarchicalclusteranalysis,HCA)分析光谱数据。结果云南重楼与近似种在植株大小、叶片、叶脉、萼片、花瓣、花亭和雄蕊等形态特征上存在典型的鉴别特征,可为其提供形态鉴别依据。6种重楼的二阶导数在3 000～2 000 cm-1和指纹区1 800～500 cm-1波段内差异明显,HCA和PLS-DA均能较好地区分云南重楼及近似种,可为其提供红外光谱鉴别证据。HCA结果表明云南重楼、七叶一枝花、狭叶重楼、矮重楼和多叶重楼亲缘关系较近。结论傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合原植物形态鉴定能够快速鉴别云南重楼及其近似种,为指导重楼栽培、临床应用和资源开发提供科学依据。     

红外光谱结合化学计量学鉴别美洲大蠊及其他虫类药材研究

目的基于红外光谱法结合化学计量学建立美洲大蠊及其他虫类药材(全蝎、水蛭)粉末的鉴别方法,为美洲大蠊的鉴别提供一定的依据。方法运用傅里叶变换红外光谱仪采集3种虫药药粉的红外光谱数据,对已得光谱数据二阶求导后运用纵坐标归一化法、标准化法等预处理方法对光谱进行优化,采用化学计量学,包括系统聚类分析(hierarchicalcluster analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)以及偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)进一步对光谱数据进行分析。结果美洲大蠊与全蝎、水蛭的红外指纹图谱有差异。美洲大蠊在1 711、1 410、712 cm-1处吸收峰明显,全蝎在1 753、1 400、1 168、717 cm-1处吸收峰明显,水蛭在1 558、1 457、1 400、669 cm-1处吸收峰明显,且水蛭在1 753～1 711cm-1处明显无吸收峰。3种虫类药材在1 800～1 700 cm-1处峰形差异明显较大。二阶导数图谱中,主要峰的位置相同,但共有峰的强度不同。运用HCA分析方法发现3种虫类药材能够被快速区分,运用PCA与PLS-DA分析方法发现3种虫类药材分布在不同区域。结论本研究能够简便、快速的鉴别美洲大蠊与全蝎、水蛭等虫类药材,为美洲大蠊的质量控制及评价提供参考。     

基于HPLC指纹图谱鉴别云南重楼和长柱重楼

目的通过HPLC指纹图谱鉴定云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz和长柱重楼Paris forrestii(Takht.)H.Li.。方法建立20批样品的HPLC指纹图谱,SPSS19.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果云南重楼与长柱重楼HPLC指纹图谱的相似度分别为0.905~0.998和0.905~0.986,聚类分析与主成分分析均可将两者明显区分开。结论该方法专属性强、准确度高,可用于重楼属植物的品种鉴定及质量控制。     

红外光谱结合化学计量学对栽培滇重楼的产地鉴别研究

目的 比较滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis不同生长年限不同产地红外光谱特征,建立产地鉴别模型。方法 收集13个产地3～8年生栽培滇重楼样品,共计841株个体;通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪(attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectra,ATR-FTIR)采集样品红外光谱;结合多元散射校正(multiplicative scattering correction,MSC)、一阶导数(first derivative,FD)、二阶导数(second derivative,SD)和三阶导数(third derivative,TD)筛选最佳光谱预处理方式;利用偏最小二乘判别模型(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)鉴别相同生长年限不同产地的样品。结果 三阶导数与多元散射校正结合是对3年生和5～8年生样品进行产地鉴别的最佳光谱预处理方式;二阶导数与多元散射校正结合是鉴别4年生不同产地样品最佳光谱预处理方...     

不同生长期当归红外光谱的偏最小二乘分析

目的:研究偏最小二乘(PLS)方法在不同生长期当归傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析中的应用.方法:使用正交信号校正及小波压缩(OSCW)对原始FT-IR信号进行预处理,然后对预处理后的光谱信号进行PLS分析,提取前2个主成分对3种不同生长期的当归进行聚类.结果:3种生长期的当归被正确地分为3类,聚类结果与当归的生长期密切相关,反映了不同生长期当归在主要化学成分含量上存在一定的差异.结论:对光谱信号进行正交信号校正及小波压缩处理能够有效降低光谱信号的噪声,有助于提高聚类性能.     

基于多元统计学方法的维药没食子药材红外光谱研究

目的：建立了不同批次的没食子药材红外光谱、二阶导数红外光谱,结合多元统计分析对25批没食子进行了研究,为没食子药材鉴别提供新的方法。方法：采用傅里叶变换红外光谱仪采集不同批次没食子药材红外光谱,利用OMNIC软件对25批没食子药材样品的红外指纹图谱进行基线校正、平滑等处理,采用Microsoft Excel2016进行正态分布分析,采用SPSS 22.0软件进行聚类分析和主成分分析,采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法-判别分析,以变量重要性投影（VIP）值>1为标准,筛选影响没食子药材成分质量的标志性波数。结果：对25批没食子药材样品进行了红外光谱分析,其相关系数为0.932 7～0.995 6。二阶导数图谱可以分离出原光谱中的一些相互重叠的吸收峰。正态分布曲线结果表明,广西来源与安徽来源没食子药材质量存在明显差异,中国广西、广东与伊朗哈吉阿巴德来源没食子药材样品质量相近。聚类分析表明,25批没食子药材在10～15个组间的间距下可以聚成4类。主成分分析发现,累积方差贡献率为89.565%;广西来源没食子药材的综合得分最高,安徽来源没食子药材的综合得分最低。正交偏最小...     

三七及其三个近缘种的红外光谱分析

采用红外光谱一维谱图及二阶导数宏观指纹鉴定的方法对屏边三七、疙瘩七、峨眉三七和种植三七的块根、叶原药材的红外光谱图进行了整体的分析。原药材红外光谱一维谱图及二阶导数图谱显示,屏边三七、疙瘩七、峨眉三七和种植三七为近缘种种质资源的关系,初步判断种植三七与峨眉三七的种缘关系最近,屏边三七与疙瘩七的种缘关系较为接近。     

UV结合MIR光谱探讨地黄炮制过程糖的动态变化规律

目的 探讨地黄九蒸九制过程中糖的动态变化规律,建立快速鉴别不同蒸制次数地黄的方法。方法 采用紫外分光光度计测定不同蒸制次数地黄多糖含量;采集不同蒸制次数地黄的红外光谱,运用聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析对红外光谱进行差异性分析。结果 随着蒸制次数的增加,地黄中多糖含量逐渐升高,在第五次蒸制时出现转折,而后急剧下降,六次蒸制后多糖含量变化波动范围很小,最后趋于动态平衡。建立的红外图谱共标定8个共有峰,聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析结果显示,生地、第五次蒸制的熟地黄各自聚为一类;第一、二、三、四次蒸制的熟地黄聚为一类;第六、七、八、九次蒸制的熟地黄聚为一类,正交偏最小二乘法-判别分析筛选出两个差异贡献波段3392cm^-1和1153cm^-1,其中1153cm^-1是糖苷的特征吸收峰波段。结论 不同蒸制次数地黄之间存在明显差异,红外光谱结合化学计量学可为快速鉴别地黄蒸制次数提供理论参考。     

丛枝菌根真菌对滇重楼内源激素的影响

目的初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律。方法以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量。结果接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性。与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反。结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量。     

重楼提取物抗骨肉瘤作用及机制研究

目的探讨重楼提取物(PPEE)抗骨肉瘤作用及其机制。方法不同质量浓度的PPEE处理骨肉瘤细胞,采用MTT法、Hoechst 33342染色、流式细胞术、Matrigel培养、免疫印迹法分别检测细胞增殖抑制率、细胞凋亡、细胞周期、血管生成拟态(VM)形成及相关蛋白表达情况。裸鼠移植瘤模型观察PPEE的体内抑瘤效果。结果 PPEE对骨肉瘤细胞半数抑制浓度(IC50)为10～60μg/m L,对成骨细胞增殖影响较小。PPEE可浓度依赖性地将骨肉瘤143B细胞阻滞在G2/M期,上调细胞周期相关蛋白p-CDK1、p-Cdc25C、p-Chk2表达,下调cyclinB1表达;促进细胞凋亡,上调cleavedCaspase-3、8、9和PARP表达,上调Bax/Bcl-2;抑制细胞体外VM形成,下调FAK、Mig-7、MMP-2和MMP-9表达。体内实验显示PPEE能明显抑制骨肉瘤生长和体内VM形成,延长荷瘤裸鼠生存期。结论 PPEE在体内外均具有良好的抗骨肉瘤活性,其作用机制可能与诱导骨肉瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期及破坏骨肉瘤VM形成有关。     

高温胁迫对滇重楼生理指标的影响

目的探究滇重楼对高温抗性适应能力,为滇重楼在中南地区规模化引种栽培提供依据。方法以滇重楼生长健壮苗为实验材料,在25℃/20℃(昼温/夜温)、33℃/28℃(昼温/夜温)、39℃/34℃(昼温/夜温)的不同温度条件下连续胁迫处理7 d,测定其叶片生理指标,并进行显著性与相关性分析。结果随着温度的升高与胁迫时间的持续延长,在33℃/28℃与39℃/34℃下处理7 d后,滇重楼叶相对含水量明显下降,分别比对照(25℃/20℃)低17.38%、58.25%;相对电导率与丙二醛(MDA)含量均持续上升,其中39℃/34℃处理下上升幅度最大,电导率比对照高3.59倍,MDA含量比对照高2.55倍;39℃/34℃处理下可溶性糖含量逐渐下降,比对照低33.25%;可溶性蛋白含量均呈波浪状变化,33℃/28℃处理组波动幅度较大,7 d后上升为对照的1.32倍;处理组超氧化物歧化酶(SOD)活性均先升高后下降,39℃/34℃处理组4 d后达到峰值,比对照高2.35倍;处理组过氧化物酶(POD)活性均逐渐上升,39℃/34℃处理组4 d后上升为对照的2.33倍,之后变化幅度逐渐减缓。结论温度对滇重楼的各项生理指标均有明显的影响,温度为25℃/20℃条件下,植物生长状态良好,为适宜生长温度,33℃/28℃温度条件下,长时间的持续胁迫处理会引起植株叶片损伤,39℃/34℃持续高温胁迫则会严重损伤植株生理活性与形态结构,严重时甚至会导致植株死亡。     

基于生物量和活性成分的滇重楼幼苗优良菌根真菌筛选

目的以菌根生活力、根茎生物量和活性成分为指标,筛选适宜滇重楼幼苗生长发育的优良丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌。方法以灭菌土壤为生长基质,采用室温盆栽试验,研究接种28种外源性AM真菌对滇重楼幼苗菌根生活力、根茎生物量和重楼皂苷产量(单株幼苗所含的重楼皂苷量、重楼皂苷含量与幼苗生物量的乘积)、根茎重楼皂苷与核苷含量的影响。结果接种的28种AM真菌与滇重楼幼苗均形成了共生体系并且发育良好,并能提高滇重楼幼苗菌根生活力,但具有偏好性。大多数AM真菌处理组能提高滇重楼根茎生物量,促进了滇重楼幼苗重楼皂苷和重楼核苷的积累,表现为重楼皂苷含量和产量的提高。菌根形成对滇重楼幼苗次生代谢的影响还表现在重楼皂苷和重楼核苷的器官分配上,菌根化滇重楼幼苗须根中4种重楼皂苷总量具有高于根茎的趋势,而根茎中9种核苷总量明显高于须根。结论本研究中不同AM菌株的表现,对进一步提高滇重楼幼苗生物量和品质的菌株筛选具有重要的借鉴作用,巨大巨孢囊霉Gigasporagigantea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、沾屑多孢囊霉Diversispora spurca、异配盾孢囊霉Dentiscutata heterogama、沙荒球囊霉Septoglomus deserticola、薄壁两性囊霉Ambispora leptoticha可望能作为培育滇重楼菌根化苗的理想菌株。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

滇重楼内生真菌米曲霉中1个新的聚酮类化合物

目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae次生代谢产物的化学成分,以期发现新的化合物。方法采用液体发酵方式发酵,萃取后运用硅胶及大孔吸附树脂等多种色谱技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从滇重楼内生真菌米曲霉发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别鉴定为3-氨基-4,5-二羟基-4,6-二甲基-2-(2-甲基丁酰)环己-2-烯酮(1)、12-N-甲基-环-(L-色氨酰-L-苯丙氨酰)(2)和二聚色氨酸素(3)。结论化合物1为新的聚酮类化合物,命名为米曲霉聚酮A。     

混合丛枝菌根真菌接种时期对滇重楼幼苗内源激素含量的影响

目的研究混合丛枝菌根(AM)真菌不同接种时期对滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis幼苗内源激素含量的影响。方法室内盆栽法,分别将滇重楼种子、1年生苗、2年生苗接种混合AM真菌,于灭菌土壤基质中进行共生培养,采用高效液相色谱法测定内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)含量。结果混合AM真菌对不同时期,不同种源的滇重楼根状茎和根中内源激素ZR、GA、IAA、ABA含量变化的影响不尽相同。整体上,与对照组比较,野生种源和栽培种源滇重楼根状茎和根的ZR和GA内源激素含量均呈增加趋势,ABA含量均呈减少趋势。滇重楼根状茎和根中IAA/ABA、GA/ABA、ZR/ABA增大。结论 1年生苗期接种S2、S6型混合AM真菌,对促进滇重楼幼苗根状茎和根生长的综合效果最佳。     

多因素处理对云南重楼及其多芽品系种子萌发的影响

目的探讨温度、内源激素、授粉方式等条件对云南重楼及其多芽品系种子萌发和出苗的影响进行研究,建立促进云南重楼种子萌发技术体系,为重楼种子育苗提供科学指导,缓解目前重楼优质种源严重不足、商品药材严重供不应求、市场价格高居不下的瓶颈问题。方法采用湿沙培养各条件下处理过的云南重楼种子,测定发芽率和平均发芽时间,并将催芽后的种子播种于大田,考察出苗率、平均出苗时间。结果经4～18℃变温湿沙培养处理的重楼种子获得了较高的发芽率和出苗率;赤霉素处理能促进云南重楼种子的萌发,缩短平均发芽时间,100、200 mg/L赤霉素处理效果较好;人工授粉的种子发芽率和出苗率显著高于自然授粉的种子(P0.05);云南重楼及其多芽品系间发芽率和出苗率无明显差别。结论将除去外种皮的人工授粉的种子用100 mg/L赤霉素处理,经4～18℃变温湿沙培养至萌芽,萌芽种子播种于大田,可缩短云南重楼种子的出苗周期1年,获得高达80%以上的出苗率。