有效抑制大鼠背根神经节细胞TRPV4通道小干扰RNA的筛选

目的:以不同浓度以及序列的小干扰RNA(SiRNA)转染,培养大鼠的背根神经节(DRG),观察对神经元形态、活性变化以及瞬时感受器电位离子4(TRPV4)通道功能的影响,筛选转染这种神经元的SiRNA。方法:取新生大鼠腰背段全部DRG,将处理好的DRG神经元进行培养,将神经元随机分为正常对照组、SiRNA不同浓度组、错配组,进行SiRNA转染,然后培养相应时间后观察各组神经元在荧光显微镜的形态学特点,并用四甲基偶氮唑兰比色法(MTT)分析各组神经元细胞生长活性的改变。另外利用Fluo3荧光探针,观察SiRNA作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应,采用酶联免疫法方法观察KCl刺激下各组细胞释放P物质的改变。结果:荧光显微镜下观察适宜浓度组SiRNA转染DRG神经元形态较正常组无明显差异。MTT法比较10-40nM各组神经元活性的差异无显著性意义。而SiRNA作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应以及细胞释放P物质的改变有显著差异。结论:40-80nMSiRNA可以有效转染DRG细胞,未对DRG神经元活性产生显著影响,这为研究TRPV4通道功能提供了一个有效的方法。     

牛磺酸对液压冲击伤后大鼠神经元内Ca2+超载的影响

目的 探讨牛磺酸对液压冲击伤导致的体外培养的大鼠神经元内Ca^2＋超载的影响。方法 将体外培养的大鼠神经元细胞随机分为正常对照（24h、48h）组、液压冲击伤（24h、48h）模型组、牛磺酸（伤后24h、48h）治疗组，以Fluo-3／AM为细胞内钙离子荧光指示剂，用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）测定各组神经元细胞内Ca^2＋的变化。结果 神经元细胞损伤后，伤后24h神经元胞质内钙离子浓度达高峰，48h仍维持在较高水平；于伤后立即给与牛磺酸治疗24h或48h，均能减轻损伤神经元细胞内的钙超载。结论 牛黄酸对液压冲击伤后大鼠神经元内Ca^2＋超载有较好的保护作用。     

缺血再灌注大鼠脑组织提取液体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化

背景:骨髓基质细胞最终成为神经元需要经历定向及分化两个过程,定向及分化是含有相同基因库的细胞不同基因表达的结果,基因表达需要一定的条件,胞外基质的变化可引起细胞形态学及基因表达方式的改变.目的:观察骨髓基质细胞在损伤大鼠脑组织提取液诱导下,向神经元样细胞分化的可能性.方法:取第5代转染绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞,分别用缺血再灌注/正常大鼠脑组织提取液进行诱导分化培养,并设立空白对照.相差显微镜下观察细胞形态变化,并行免疫组织化学染色鉴定.结果与结论:原代培养的骨髓基质细胞纯化、扩增后呈均匀一致的长梭形,第3代细胞均一表达CD44,CD106,不表达CD34.荧光显微镜下,绿色荧光蛋白转染后24 h可观察到骨髓基质细胞有荧光表达,但强度稍弱;48 h后大多数细胞发出明显绿色荧光.加入缺血再灌注大鼠脑组织提取液后,诱导细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且神经元特异性烯醇化酶特异性抗体呈阳性表达.与空白对照组比较,缺血再灌注大鼠脑组织提取液组和正常大鼠脑组织提取液组骨髓基质细胞分化率均明显升高(P < 0.05),且前组升高幅度明显大于后组(P < 0.05).提示缺血再灌注大鼠脑组织提取液能将骨髓基质细胞成功诱导为神经元样细胞.     

三磷酸腺苷保护脊髓损伤神经元的细胞活力

目的:观察核苷酸类神经营养因子三磷酸腺苷对大鼠脊髓神经元损伤后细胞活力的影响。方法:取新生Wistar大鼠20只,切取脊髓,剪碎组织成糜状进行神经细胞培养。将培养的神经细胞分为3组,①无损伤对照组,继续完全培养液培养。②损伤组,培养第7天神经元用微量移液器塑料滴头行机械性划痕损伤后完全培养液培养。③三磷酸腺苷组,培养第7天神经元划痕损伤后加入终浓度为1.0mmol/L的三磷酸腺苷培养液培养。倒置相差显微镜观察细胞生长及不同时期细胞形态变化,各组于处理后10min,1,12,24和48h,细胞损伤程度,以乳酸脱氢酶法检测(乳酸脱氢酶渗漏量比值越大,说明细胞损伤越重)。检测各组细胞活性采用四甲基偶氮唑盐比色法(四甲基偶氮唑盐代谢率吸光度越高,说明细胞活性越高)。结果:①各组细胞损伤程度评估:以培养液中乳酸脱氢酶含量表示。伤后1,12,24和48h,损伤组和三磷酸腺苷组较对照组明显增加(P<0.05);损伤24和48h,三磷酸腺苷组低于损伤组(17.94±0.82,23.05±1.04;18.52±1.12,24.88±1.16;P<0.05)。②体外培养的各组大鼠损伤神经元的变化:以四甲基偶氮唑盐代谢率表示。伤后1,12,24和48h,损伤组和三磷酸腺苷组明显低于对照组(P<0.05),损伤24和48h,三磷酸腺苷组高于损伤组(0.24±0.03,0.18±0.04;0.27±0.03,0.15±0.05;P<0.05)。结论:细胞外三磷酸腺苷可以减轻机械性损伤后的脊髓神经元的损伤程度,增强细胞活力,对受损伤的神经元有一定的保护作用。     

新生大鼠培养海马神经元的双重转染和活细胞成像

目的建立新生大鼠海马神经元的双重转染和活细胞成像方法。方法出生24h内的SD大鼠海马神经元原代培养,接种后第5天双重转染表达绿色荧光蛋白的GFP-GluR1和红色荧光的DsRed,活细胞成像观察转染后细胞情况。结果转染48h后神经元基本稳定,发绿色荧光,胞体大呈多边,立体感强,突起长且连接密集;可以在不同时间点定位观察同一部位;双重转染GluR1-GFP和DsRed质粒48h后,可在倒置显微镜下观察到荧光,GluR1-GFP表达于树突,DsRed表达于树突棘。结论获得了稳定可行的神经元双重转染技术和长时程在不同时间点定位追踪观察培养神经元的成像方法。     

三磷酸腺苷保护脊髓损伤神经元的细胞活力

目的：观察核苷酸类神经营养因子三磷酸腺苷对大鼠脊髓神经元损伤后细胞活力的影响。方法：取新生Wistar大鼠20只，切取脊髓，剪碎组织成糜状进行神经细胞培养。将培养的神经细胞分为3组，①无损伤对照组。继续完全培养液培养。②损伤组，培养第7天神经元用微量移液器塑料滴头行机械性划痕损伤后完全培养液培养。③三磷酸腺苷组，培养第7天神经元划痕损伤后加人终浓度为1．0mmol／L的三磷酸腺苷培养液培养。倒置相差显微镜观察细胞生长及不同时期细胞形态变化，各组于处理后10min，1，12，24和48h，细胞损伤程度，以乳酸脱氢酶法检测(乳酸脱氢酶渗漏量比值越大，说明细胞损伤越重)。检测各组细胞活性采用四甲基偶氮唑盐比色法(四甲基偶氮唑盐代谢率吸光度越高，说明细胞活性越高)。结果：①各组细胞损伤程度评估：以培养液中乳酸脱氢酶含量表示。伤后1，12，24和48h，损伤组和三磷酸腺苷组较对照组明显增加(P&;lt;0．05)；损伤24和48h，三磷酸腺苷组低于损伤组(17．94&;#177;0．82．23．05&;#177;1．04；18．52&;#177;1．12，24．88&;#177;1．16；P&;lt;0．05)。②体外培养的各组大鼠损伤神经元的变化：以四甲基偶氮唑盐代谢率表示。伤后1，12,24和48h，损伤组和三磷酸腺苷组明显低于对照组(P&;lt;0．05)，损伤24和48h，三磷酸腺苷组高于损伤组(0．24&;#177;0．03，0．18&;#177;0．04：0．27&;#177;0．03，0．15&;#177;0．05：P&;lt;0．05)。结论：细胞外三磷酸腺苷可以减轻机械性损伤后的脊髓神经元的损伤程度，增强细胞活力，对受损伤的神经元有一定的保护作用。     

人参皂甙Rg1对大鼠海马神经元缺糖氧/复糖氧后氧化损伤的保护作用

目的观察人参皂甙Rg1 对大鼠海马神经元缺糖氧/复糖氧后谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的影响。方法海马神经元培养8~10 d,随机分为正常对照组、模型组、人参皂甙Rg1 低、中、高剂量组(5 μmol/L, 20 μmol/L, 60 μmol/L)。建立大鼠海马神经元缺糖氧/复糖氧模型,复糖氧后6 h 以生物化学法观察各组海马神经元GSH含量和GPx活性的变化;复糖氧后24 h 以Hochest 染色法检测细胞凋亡,并检测各组海马神经元四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率。结果与模型组相比,人参皂甙Rg1中、高剂量组海马神经元GSH含量、GPx活性显著升高,凋亡显著减少,MTT代谢率显著提高(P<0.001),人参皂甙Rg1 低剂量组变化不明显(P>0.05)。结论人参皂甙Rg1 可通过提高缺糖氧神经元GSH含量和GPx活性,发挥脑保护作用。     

人参皂苷Rg1对大鼠海马神经元缺糖氧／复糖氧后钙内流的影响北大核心CSCD

目的观察人参皂苷Rg1对大鼠海马神经元缺糖氧／复糖氧后钙内流的影响,并探讨其可能的脑保护机制。方法建立大鼠海马神经元缺糖影复糖氧模型,随机分为正常对照组、模型组和人参皂苷Rg1干预组（5、20、60μmol／L）。复糖氧后24h以Fluo-3 AM荧光染色法观察各组海马神经元细胞内钙离子浓度变化,以Hoechst染色法检测细胞凋亡,并检测细胞四甲基偶氮唑盐（MTT）代谢率。结果与模型组比较,人参皂苷Rg1中、高剂量组海马神经元细胞内钙离子浓度降低,凋亡细胞减少,MTT代谢率升高,人参皂苷Rg1低剂量组变化不明显。结论脑缺血后神经元细胞内钙超载与脑损伤关系密切,人参皂苷Rg1可通过减少缺糖氧神经元细胞内钙内流,发挥脑保护作用。     

磁刺激对大鼠离体神经干细胞生长和分化的影响

目的 观察磁刺激对离体新生大鼠神经于细胞生长和分化的影响。方法 利用无血清培养技术，从新生大鼠脑室下区分离培养神经于细胞。将神经于细胞置于0．5Hz，刺激强度分别为0．48T(25％最大输出，B组)、0．95T(50％最大输出，c组)和1．44T(75％最大输出，D组)的条件下进行磁刺激干预，每天1次，每次30个脉冲，作用3d，同时设立对照组(A组)，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性(0D值)，并用流式细胞技术检测神经于细胞分化情况。结果磁刺激各组神经于细胞在于预后24～48h0D值较A组稍低(P＜0．05)，至72h后可恢复至A组水平；流式结果显示磁刺激各组神经丝蛋白(NF)阳性细胞比例均高于A组，其中D组NF阳性神经元的比例最高(P＜0．05)。结论0．5Hz磁刺激对神经于细胞增殖有一过性的轻度抑制作用，有利于神经于细胞向神经元方向的分化。     

白质星形胶质细胞内S100A4蛋白对小鼠背根神经节细胞突起生长的影响

目的 研究离体条件下白质星形胶质细胞及其表达的S100A4蛋白对小鼠背根神经节（DRG）细胞突起生长的影响。方法 用对照siRNA或S100A4siRNA转染纯的白质星形胶质细胞，3d后与成年小鼠DRG细胞共同培养6，12，18，24h，采用免疫荧光化学方法观察DRG细胞突起的生长情况。结果 在多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，成熟的DRG细胞能较好地存活，但在培养24h内未见有突起长出。与白质星形胶质细胞共培养6h，各组DGR细胞均未长出突起；共同培养12，18，24h，各组DGR细胞长出突起，且突起长度随共同培养时间的延长而增加；S100A4siRNA转染组DRG细胞突起明显长于培养相同时间的对照siRNA转染组。结论 白质星形胶质细胞促进小鼠DRG细胞突起生长，而星形胶质细胞内的S100A4蛋白抑制该作用。     

神经干细胞微囊泡抑制H2O2 诱导DRG 神经元氧化应激损伤机制研究

目的 探究神经干细胞微囊泡（neural stem cell microvesicles, NSC-MVs）对H2O2 诱导背根神经节（dorsal rootganglion, DRG）神经元氧化应激损伤的作用及机制。方法 超速离心提取NSC-MVs，并进行电镜和纳米颗粒示踪分析。原代培养大鼠DRG 神经元，β-tubulin Ⅲ荧光染色。建立H2O2 诱导DRG 神经元氧化应激损伤模型，确定作用浓度。经NSC-MVs 预处理，MTT( 四唑盐) 检测神经元活力，流式细胞术检测Annexin Ⅴ和PI，蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase 3，cleaved caspase 9，Bax 和Bcl-2 的表达。结果 NSC-MVs 在透射电镜下呈圆盘状，包膜完整，纳米颗粒示踪显示其粒径为50 ～ 450 nm。MTT 结果显示，与对照组相比，H2O2 组神经元活力明显抑制。当H2O2 浓度为25，50，100 和200μmol/L 时具有显著性差异，细胞活力分别为84.4 %，73.7 %，69.8 % 和49.5 %（F=127.7，P ＜ 0.01）。经100，200 和400 μg/ml 的NSC-MVs 预处理DRG 神经元，细胞活力得到明显提升，分别为51.4 %，67.4 % 和73.5 %（F=49.47，P=0.023）。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，H2O2 组神经元凋亡率显著上升（P ＜ 0.05），NSCMVs预处理组细胞凋亡率明显下降（P ＜ 0.05）。蛋白质印迹结果显示，与H2O2 组相比，NSC-MVs 显著抑制cleavedcaspase3，cleaved caspase 9 和Bax 蛋白表达（均P ＜ 0.05），上调Bcl-2 蛋白表达（P ＜ 0.05）。结论 NSC-MVs 能够抑制H2O2 诱导DRG 神经元氧化应激损伤，发挥神经保护作用。     

大鼠背根神经节神经元细胞纯化培养的模型建立

目的:建立一种切实可行的新生SD大鼠背根神经节神经元培养及纯化方法.方法:用显微解剖方法获取足够数量新生大鼠背根神经节,通过胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用DF-12培养基和加有阿糖胞苷抗有丝分裂的DF-12培养基培养等方法,在体外获得纯化的背根神经节神经元,并采用NSE免疫细胞化学染色方法检测神经元的纯度.结果:获得的背根神经节神经元在体外生长良好,纯度可达到90%以上.结论:本方法可以获得大量高度纯化的大鼠背根神经节神经元.     

Enhanced excitability of dissociated primary sensory neurons after chronic compression of the dorsal root ganglion in the rat

A chronic compression of the dorsal root ganglion (CCD) produces ipsilateral cutaneous hyperalgesia and allodynia in rats. Intracellular electrophysiological recordings from formerly compressed neurons in the intact dorsal root ganglion (DRG) reveal lower than normal current thresholds (CTs) and abnormal spontaneous activity (SA) (Zhang JM, Song XJ, LaMotte RH. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol 1999;82:3359-66). To determine if the neuronal hyperexcitability is intrinsic to the soma, L4 and L5 DRG neurons from rats that had prior CCD surgery or those that did not (controls) were dissociated, and intracellular recordings obtained 3-8 h (acute) or 24-30 h (1d) after culture. The CTs of large- (>45 microm diameter) and medium- (30 approximately 45 microm) sized neurons from control rats after acute or 1d culture were similar to those formerly recorded from the intact DRG and significantly lower for CCD than for control rats. However, the CTs of small- (相似文献   

Evoked bursting in injured Aβ dorsal root ganglion neurons: a mechanism underlying tactile allodynia

Chronic compression of rat dorsal root ganglion (CCD) produced tactile allodynia accompanied with hyperexcitability of the myelinated Aβ dorsal root ganglion (DRG) neurons. The Aβ DRG neuron hyperexcitability exhibits as bursting discharges in response to peripherally evoked action potentials (evoked bursting [EB]). The incidence of EB was significantly increased after chronic compression of DRG (CCD) (43.3%) vs control (13.3%). EB was maintained by oscillation of the membrane potential, and its duration was increased when the membrane potential was depolarized. EB was found to coexist in some neurons with spontaneous bursting (SB), but EB always occurred at a more negative membrane potential than SB. Afterdischarges of the wide dynamic range neurons of the dorsal horn in the spinal cord in response to electrical stimulation of Aβ afferent nerve fibers were suppressed by blocking EB of the DRG neurons. CCD neurons with EB exhibited increased current density of persistent sodium current (I(Nap)) and hyperpolarization-activated cation current (I(h)) and decreased α-dendrotoxin (α-DTX) sensitive current (I(DTX)). The increased I(h) activated by afterhyperpolarization of peripheral afferent action potential was necessary for EB generation and a balance between I(DTX) and I(Nap) might be necessary for EB maintenance. This study may suggest a role of EB of myelinated DRG neurons in development of allodynia after nerve injury and a potential pharmaceutical therapy in treating neuropathic allodynia.     

坐骨神经震荡伤后腰髓背根神经节病理改变及意义

目的　应用图像分析和免疫组织化学技术观察和分析兔坐骨神经高速弹丸震荡伤后腰髓背根神经节病理改变及意义。方法　大耳白兔 2 5只 (包括正常对照 5只 ) ,致伤靶点为右后肢外侧坐骨神经体表投影线中点 (0 38g钢珠 ,0 6 5g装药量 ) ,观察伤后 1、3、7、14d(n =5 )腰髓背根神经节病理改变及一氧化氮合酶 (nitricoxidesynthase ,NOS)表达变化 (免疫组化法 ) ,并进行神经元计数及神经元截面积图像分析。结果　腰髓背根神经节伤后发生出血、水肿、神经元皱缩、坏死等变化 ,伤后 3dNOS表达显著增强 ,伤后 7d神经元数显著减少 ,神经元平均截面积显著减少。结论　坐骨神经高速弹丸震荡伤后腰髓背根神经节发生了较重的损伤。     

硼替佐米致周围神经病变的机制及还原型谷胱甘肽逆转神经毒性的研究

目的 通过建立动物模型,研究硼替佐米致周围神经病变的机制及还原型谷胱甘肽对周围神经病变的逆转作用.方法 将雌性Wistar大鼠随机分为硼替佐米处理组,硼替佐米联合还原型谷胱甘肽处理组,生理盐水对照组.三组大鼠分别于第1、4、7、11天给药,并在实验第14及42天取坐骨神经、背根神经节(DRG)进行电子显微镜形态观察;实...     

水杨酸钠对顺铂导致的螺旋神经节细胞毒性的保护作用

目的:探讨水杨酸钠对顺铂导致的螺旋神经节细胞(SGNs)毒性的保护作用。方法:体外培养SGNs。分组:空白对照组,不同浓度水杨酸钠组、顺铂组和顺铂+水杨酸钠组(100～900μg/mL),加药48h后,通过显微镜下细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法对SGNs进行药物毒性检测,通过Hoechst33258进行细胞核染色,观察细胞凋亡情况。结果:顺铂(4、6、8μg/mL)对SGNs有明显毒性,促使细胞凋亡,并且随浓度增加,细胞数量明显减少,与空白对照组相比差异具有显著统计学意义(P<0.05)。结论:在体外培养的条件下,水杨酸钠在一定浓度范围内可以拮抗顺铂导致的SGNs毒性,其保护机制可能与抑制细胞凋亡有关。     

Overexpression of GDNF in the Uninjured DRG Exerts Analgesic Effects on Neuropathic Pain Following Segmental Spinal Nerve Ligation in Mice

Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), a survival-promoting factor for a subset of nociceptive small-diameter neurons, has been shown to exert analgesic effects on neuropathic pain. However, its detailed mechanisms of action are still unknown. In the present study, we investigated the site-specific analgesic effects of GDNF in the neuropathic pain state using lentiviral vector-mediated GDNF overexpression in mice with left fifth lumbar (L5) spinal nerve ligation (SNL) as a neuropathic pain model. A lentiviral vector expressing both GDNF and enhanced green fluorescent protein (EGFP) was constructed and injected into the left dorsal spinal cord, uninjured fourth lumbar (L4) dorsal root ganglion (DRG), injured L5 DRG, or plantar skin of mice. In SNL mice, injection of the GDNF-EGFP-expressing lentivirus into the dorsal spinal cord or uninjured L4 DRG partially but significantly reduced the mechanical allodynia in association with an increase in GDNF protein expression in each virus injection site, whereas injection into the injured L5 DRG or plantar skin had no effects. These results suggest that GDNF exerts its analgesic effects in the neuropathic pain state by acting on the central terminals of uninjured DRG neurons and/or on the spinal cells targeted by the uninjured DRG neurons.

Perspective

This article shows that GDNF exerts its analgesic effects on neuropathic pain by acting on the central terminals of uninjured DRG neurons and/or on the spinal cells targeted by these neurons. Therefore, research focusing on these GDNF-dependent neurons in the uninjured DRG would provide a new strategy for treating neuropathic pain.     

Voltage-gated sodium channels and the molecular pathogenesis of pain: a review

Pain pathways begin with spinal sensory (dorsal root ganglion, DRG) neurons that produce nociceptive signals and convey them centrally. Following injury to the nervous system, DRG neurons can become hyperexcitable, generating spontaneous action potentials or abnormal high-frequency activity that contributes to chronic pain. Because the generation of action potentials in DRG neurons depends on voltage-gated sodium channels, an understanding of the expression and function of these channels in DRG neurons is important for an understanding of pain. Molecular studies have indicated that at least eight distinct voltage-gated sodium channels, sharing a common overall motif but encoded by different genes that endow them with different amino acid sequences, are present within the nervous system. The DRG neurons express six different sodium channels, including several sensory-neuron-specific sodium channels that are not present at significant levels within other parts of the nervous system. Following injury to their axons within peripheral nerve, DRG neurons down-regulate some sodium channel genes, and up-regulate others. As a result, a different repertoire of sodium channels is inserted into the DRG neuron cell membrane following injury, which is a molecular change that is accompanied by changes in physiological properties that contribute to hyperexcitability in these cells. Sodium channel expression is also altered in experimental models of inflammatory pain. The multiplicity of sodium channels, and the dynamic nature of their expression, makes them important targets for pharmacologic manipulation in the search for new therapies for pain.