生物材料构建神经导管修复周围神经损伤的研究进展

神经导管是由天然或人工合成材料制成的、用于桥接神经断端的组织工程支架材料,具有引导和促进神经再生作用。目前,外科手术治疗周围神经损伤效果不尽如人意,尽管自体神经移植是周围神经损伤（＞5 mm）修复的金标准,但该方法仍存在一系列问题,如：供体来源受限、供体损伤及形态不匹配、供区神经瘤形成及运动、感觉障碍等。周围神经损伤的修复仍是临床一大难题,随着各种实验技术的发展及创新,各种生物材料构建神经导管用于修复外周神经损伤取得了可喜的成绩,临床应用生物材料构建神经导管作为自体神经移植的替代方案前景广阔。     

喉颗粒细胞瘤1例并文献复习

颗粒细胞瘤(granular cell tumor,GCT)初期被学者们认为来源于骨骼肌,而目前多数学者认同它是一种少见的来源于神经鞘雪旺(Schwann)细胞的肿瘤.尽管这种肿瘤的组织发生并不完全清楚,但是仍然具有特征性.挝     

雪旺细胞及神经干细胞与Chitosan-PLGA导管的细胞相容性

目的 研究雪旺细胞(SCs)、神经干细胞(NSCs)与内置纵行排列纳米纤维丝的静电纺丝壳聚糖-聚羟基乙酸 (Chitosan-PLGA)纳米导管材料的细胞相容性, 探讨细胞在导管材料上的黏附及定向生长情况。方法 实验分为SCs组、NSCs组、SCs-NSCs共培养组, 3组细胞分别与Chitosan-PLGA纳米导管材料复合培养, 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞存活率, 扫描电镜下观察SCs、NSCs在Chitosan-PLGA上的生长。结果 细胞存活率排序由高至低依次为共培养细胞组、SCs组、NSCs组。SCs及NSCs能贴附在Chitosan-PLGA 内置纳米纤维丝上生长并沿纤维丝定向生长。结论 雪旺细胞及神经干细胞共培养可促进细胞与Chitosan-PLGA材料的相容性。内置纵行排列的纳米纤维丝有引导细胞定向生长与迁移的作用。     

大鼠耳蜗胶质细胞的分离培养和纯化北大核心CSCD

目的探讨大鼠耳蜗胶质细胞的体外分离培养和纯化的方法,为进一步研究耳蜗胶质细胞功能提供实验基础。方法分离出生后3天的新生大鼠(18只,36耳)耳蜗轴组织,通过组织酶消化及阿糖胞苷补充法、组织酶消化及免疫磁珠分选法、组织块培养及细胞冷喷注法三种方法(各2只,4耳,均重复三次)进行耳蜗胶质细胞分离、培养和纯化,通过细胞计数、CCK-8检测以及胶质细胞标记物免疫荧光染色计算细胞的产量、活性及纯度。结果组织块培养及细胞冷喷注法获得的耳蜗胶质细胞的产量尽管最低,但其细胞活性最高并优于其它两种方法,且细胞纯度较高,接近组织酶消化及免疫磁珠分选法。结论蜗轴组织块培养及细胞冷喷注法获得的耳蜗胶质细胞活性良好且细胞纯度较高,操作简便且成本低,可作为一种便捷的耳蜗胶质细胞体外培养和纯化方法。     

大鼠胚胎神经干细胞分离培养及基因感染研究

目的建立基因工程化神经干细胞(neural stemcells,NSCs)以便为治疗感音神经性聋的研究创造条件。方法分离、培养胎鼠海马组织神经干细胞,并用巢蛋白(nestin)免疫荧光组织化学染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光组织化学染色鉴定分化细胞。通过细菌内同源重组方法构建携带有报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组腺病毒(Ad-GFP),并将其感染神经干细胞。结果①获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代后仍具干细胞特性;②97%以上的神经干细胞能被腺病毒感染;③被腺病毒感染的神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞后仍可有效表达GFP报告基因。结论本实验成功构建了携带GFP基因的重组腺病毒。从胚鼠海马组织分离、培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞,经基因工程化及传代后,仍具干细胞特性,可以作为细胞移植治疗感音神经性聋试验研究的供体细胞。     

组织工程化喉软骨的构建

目的 研究组织工程化喉支架软骨的构建方法。方法 酶消化法获取幼兔肋和关节软骨细胞并进行体外培养,传代时延长胰蛋白酶作用时间3-5 min,收集第3代培养的软骨细胞用于实验;采用溶液浇铸、模压成形和颗粒滤沥方法制备喉形态聚羟基烷酸酯类[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHH)]生物材料塑形物,接种软骨细胞形成细胞-PHBHH复合物,体外共同培养1周后,分别在成兔体内用大网膜充填复合物中空部分与整体包裹、腹内成形(9只动物)和背部筋膜瓣与肌肉组织共同充填与包裹复合物、皮下成形(9只)的方法将负载软骨种子细胞的喉形态材料塑形物植入腹腔和背部,设空白对照组(每批3只)。术后一定时间取材,大体形态观察、组织学和免疫组织化学检测评估工程化喉软骨的成形与再生情况。结果 获取的软骨细胞活性为(93±2)％,传统方法为(94±2)％(P>0.05)。制备的喉形态生物材料塑形物呈中空半面喇叭状,液体(乙醇)静态容积测定孔隙率>90％。两种体内植入法均构建出喉形态组织工程化组织,大体形态维持良好,组织学和免疫组织化学均证实为软骨组织,且形态学和组织学表现两者基本一致。结论 改良培养细胞传代过程中胰酶作用程度未影响软骨细胞的成软骨性能;PHBHH可作为喉形态塑形物的塑形和构建组织工程化软骨的     

神经干细胞应用于组织工程化人工神经的实验研究

目的探讨神经干细胞(neuronalstemcells,NSCs)应用于组织工程化人工神经修复兔10mm长面神经缺损的效果。方法日本大耳白兔36只,随机分为3组,每组12只。A组:壳聚糖管加胶原蛋白海绵加神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)加NSCs;B组:壳聚糖管加胶原蛋白海绵加NGF;C组:自体神经移植。术后12周,进行系列神经电生理检测、神经组织学观察、BrdU和S100免疫组织化学检测等检查。结果术后12周,A组的各项检测指标均优于B组(P<0.05),与C组间的差异无显著性(P>0.05)。结论NSCs可作为周围神经组织工程中的种子细胞,并应用于人工神经修复面神经缺损。     

改良嗅鞘细胞纯化培养技术

嗅神经轴突外的特殊胶质细胞——嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,0ECs）来源于嗅上皮,与轴突一起从周围的嗅上皮迁延至中枢的嗅球。与其他神经胶质细胞不同,OECs能够连接受损神经两端,促进受损神经元轴突再生并髓鞘化,同时能够分泌大量的促进神经生长的因子,部分恢复神经的功能。OECs为神经损伤的修复带来了希望,目前已成为中枢神经损伤修复的热点,在这方面的研究中,由体外培养获得高纯度的OECs并导入受损的神经部位是目前研究的方向。但在OECs的培养研究中,不可避免地面对复杂的纯化问题。我们通过相关的实验研究,掌握了重复性高,简单易行的获得高纯度、大量的OECs实验方法。     

GDNF转染雪旺氏细胞构建神经导管复合体

目的利用GDNF(胶质神经源性神经营养因子)基因转染的雪旺氏细胞和PLGA(聚乳酸/聚乙醇酸共聚物)管共同培养构建神经导管复合体。方法利用乳鼠臂丛神经和坐骨神经培养雪旺氏细胞,再把pcDNA3.1( )/GDNF质粒通过脂质体转入细胞内。利用PCR检测转染雪旺氏细胞的GDNF表达。将转染雪旺氏细胞扩增达到一定数量后,用微注射和共培养法,与PLGA管构建神经导管。通过光镜和扫描电镜检测雪旺氏细胞的生长情况。结果成功培养出雪旺氏细胞,并转入GDNF基因。转染的雪旺氏细胞可表达GDNF,PCR显示转染的雪旺氏细胞GDNF表达较正常细胞明显提高。转染的雪旺氏细胞可在PLGA管表面贴壁、生长。结论GDNF基因转染的雪旺氏细胞可与PLGA管共同构建神经导管复合体。     

雪旺细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸丝相容性的研究

目的:研究雪旺细胞与聚乳酸/聚羟基乙酸(PLGA)丝的生物相容性.方法:应用乳鼠坐骨神经和臂从神经取材进行雪旺细胞培养,经阿糖胞苷抑制成纤维细胞及差数贴壁纯化,传代增殖至一定数量,将雪旺细胞与PLGA丝复合培养,经扫描电镜观察细胞的生长情况.结果:雪旺细胞可以在PLGA丝上贴壁生长,随着时间延长,细胞可分裂增殖.结论:雪旺细胞与PLGA丝生物相容性好,可进一步应用于神经修复.     

听神经瘤主要手术径路

听神经瘤组织来源于神经外胚层Schwann细胞，初发于中枢性和周围性髓磷脂会合的前庭神经Obersteiher-Redlich区，此区位于内耳道内，肿瘤组织常充填部分或全部内耳道，然后突入到桥小脑角。听神经瘤外科手术发展至今主要有4种手术径路，即迷路径路、乙状窦后径路、颅中窝径路和耳囊径路。虽然它们有各自的手术适应证，但无论是耳神经外科或神经外科医师在选择径路时均有偏好，例如House耳研所采用迷路径路较多，而有报道说经乙状窦后径路可以切除任何大小的肿瘤。     

软性一体式PHEMA人工角膜植入碱烧伤兔角膜的电镜观察

目的 研究与评估新型软性一体式PHEMA人工角膜与碱烧伤兔角膜生物愈合的电镜特点。方法 制备兔角膜碱烧伤模型后,将软性一体式PHEMA人工角膜植入,分别于4周、8周、16周和24周后取裙边组织进行扫描电镜和透射电镜检查。结果 4周时,即有新生组织长入孔隙之中,材料与角膜组织结合紧密;迁徙入材料内的角膜细胞胞浆富含粗面内质网等细胞器,显示旺盛的合成功能;其周围有胶原、蛋白多糖等细胞外基质的沉积,并且显示出从新生到成熟的动态变化。结论 新型人工角膜的孔隙支架材料,能够允许角膜细胞及周围组织迁徙、增殖并分泌沉积细胞外基质,从而达到材料与组织的生物愈合。     

喉科学

20050360组织工程化喉软骨的构建/孙安科…//中华耳鼻咽喉科杂志.2004,39(9).606～611目的:研究组织工程化喉支架软骨的构建方法。方法:酶消化法获取幼兔肋和关节软骨细胞并进行体外培养,传代时延长胰蛋白酶作用时间3～5min,收集第3代培养的软骨细胞用于实验;采用溶液浇铸、模压成形和颗粒滤沥方法制备喉形态聚羟基烷酸酯类(PHBHH)生物材料塑形物,接种软骨细胞形成细胞PHBHH复合物,体外共同培养1周后,分别在成兔体内用大网膜充填复合物中空部分与整体包裹、腹内成形(9只动物)和背部筋膜瓣与肌肉组织共同充填与包裹复合物、皮下成形(9只)…     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定及标记

目的:探索胚胎大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记的方法.方法:分离胚胎大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;5-溴脱氧尿嘧啶(BrDU)掺入试验,并用免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况.采用荧光染料Hoechest33342标记神经干细胞并诱导其分化,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞.结果:①获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养8代后仍具干细胞特性;②荧光染料的标记率可达97%,细胞传8代后荧光亮度无明显衰减,并且分化后的细胞核中仍有荧光表达.结论:成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及核多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞;荧光染料的标记可获得较高的标记率,可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞.     

新生豚鼠海马神经干细胞分化为类毛细胞的体外实验

目的体外定向诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化为内耳毛细胞。方法将原代培养的新生豚鼠海马来源的神经干细胞进行体外培养,分别置入含有10%胎牛血清和5%～15%人工外淋巴液培养基使其分化,并用免疫荧光化学,蛋白免疫印迹扫描电镜对分化的细胞进行鉴定。结果胎牛血清和人工外淋巴液均能诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化为表达毛细胞特异抗体的细胞。结论神经干细胞在胎牛血清和人工外淋巴液中可以存活并分化出表达毛细胞特异抗体的细胞,为神经干细胞移植内耳治疗提供理论依据。     

一般问题

20050710兔骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨组织的实验研究/黄定强…//临床耳鼻咽喉科杂志.2005,19(4).168～169,172目的:探索兔骨髓间充质干细胞向软骨组织转化的条件,为组织工程寻找新的工程化软骨。方法:用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,并传代扩增后,用离心三维培养法在成软骨诱导剂下进行诱导培养,并分别在诱导培养第7、14、21天取出标本并进行组织切片,对标本行免疫组织化学、原位杂交检测。结果:骨髓间充质干细胞经7、14、21天的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织学切片可见软骨陷窝,进行Ⅱ型胶原…     

组织工程化兔耳廓软骨的实验研究

目的探讨采用表面修饰过的壳聚糖(chitosan)-聚乳酸(polylacticacid,PLA)-聚乙内酯(polycrylactone,PCL)及牛跟腱胶原海绵作为支架培养组织工程化耳廓软骨的可行性,比较动态与静态两种不同培养方法对软骨生长的影响.方法将4周龄新西兰大耳白兔耳廓软骨细胞接种在20个壳聚糖-PLA-PCL及牛跟腱Ⅰ型胶原海绵支架上,将细胞支架复合物分为2组,动态组(样本量为10)采用旋转培养,静态组(样本量为10)采用静置培养.所有标本体外培养1周,裸鼠或兔皮下培养8周.分别于体外1周、体内4周及8周时取样行扫描电镜检查、大体及组织学观察以及免疫组化分析,测定软骨细胞数及细胞外基质中的Ⅱ型胶原含量.结果表面修饰过的壳聚糖支架上软骨细胞贴壁率高,细胞分化与增殖好;每个时段动态组生成的软骨细胞量及Ⅱ型胶原均较静态组多,两组间差异有显著性(P<0.05);2种生物支架上均长出了组织工程软骨;裸鼠皮下较兔皮下形成的软骨更接近天然软骨.结论壳聚糖-PLA-PCL及牛跟腱胶原海绵是较理想的组织工程耳廓软骨的支架材料,动态培养更有利于新生软骨组织的生成;兔皮下仅能形成软骨样组织.     

内耳毛细胞再生与神经干细胞

本文对内耳神经干细胞或神经前体细胞的培养,内耳毛细胞再生的细胞来源及外源性神经干细胞内耳移植的研究现状进行简要阐述.     

大鼠血管纹边缘细胞的原代培养及IsK的表达

目的：为进一步研究内淋巴生成的可能机制以及影响因素，提供可供研究的大量实验材料-边缘细胞(marginal cell，MC)，建立大鼠来源的MC的原代培养体系。方法:利用大鼠耳蜗的侧壁组织作为组织块种植培养。从第2天开始每日倒置显微镜观察，选特征性的表现照相。经选择性消化．差异性贴壁等方法抑制FLC生长，纯化MC。经过MC的形态．生长特征的观察；细胞角蛋白18．波形蛋白的免疫细胞化学；扫描及透射电镜；RT—PCR检测IeK蛋白mRNA的表达等方法鉴定MC。结果：新鲜组织块淡黄、透明，可见丰富的毛细血管网；但血管纹结构致密，倒置显微镜下不易分辨不同细胞的轮廓。MC从组织块迁移出来多在培养第2天，呈多角形外观．核大而圆、颜色较暗淡，细胞之间连接紧密，形成上皮单层时呈“铺路石样”外观。FLC呈梭形，呈“鱼群样”包绕MC生长，增殖速度快于MC。由纯化的MC构成的上皮单层表面可见由成百上千个MC包绕液体而成的dome，这提示MC净向的跨上皮转运功能。原代MC表达细胞角蛋白和波形蛋白，微绒毛丰富．细胞间连接提示其上皮起源。IsK蛋白mRNA的表达证实了培养上皮细胞的MC起源。结论：离体培养的耳蜗边缘细胞具有与其在体相同的形态及生理特征。MC原代培养体系的建立，可为进一步探讨边缘细胞的生理功能及某些内耳疾病的病理机制提供良好的研究材料。     

大鼠神经干细胞生长及增殖规律的体外研究

目的:体外无血清条件下培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.方法:取孕16～18 d SD系大鼠的胚胎海马组织,在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基中培养,电子显微镜下观察其增殖分化过程,并通过免疫荧光方法鉴定分化后的细胞类型.结果:神经干细胞在无血清培养基中生长旺盛,8 d左右就可以形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,分化后的细胞显示NSE、GFAP免疫阳性.结论:无血清培养条件下神经干细胞生长良好,而在含血清的培养基中可以分化为神经元和星形胶质细胞.