同源盒基因Pax-6在鼠晶状体上皮细胞中的表达分析

目的 观察体外培养的小鼠晶状体上皮细胞(LEC)内同源盒基因Pax-6的表达,探讨维持晶状体上皮细胞特性的基因因素。方法 体外培养小鼠原代、传1代、传2代及传3代LEC,利用免疫组织化学法和免疫印迹法,检测细胞中Pax-6基因的蛋白表达情况,利用逆转录聚合酶链反应法检测细胞中Pax-6基因的mRNA表达情况。结果在原代、传1代及传2代培养的LEC中均可检测到Pax-6基因蛋白和mRNA的阳性表达,传3代培养的LEC中仅检测到Pax-6基因蛋白的微弱表达。阴性对照均未见,Pax-6基因的表达。结论 体外培养的小鼠LEC中具有Pax-6基因,该基因的正常表达是维持LEC特性的必要条件。     

角膜上皮细胞Pax—6基因表达分析

目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况.结果EcoRⅠ酶切角膜缘上皮细胞中9.1kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western     

bFGF在体外培养的晶状体上皮细胞中的表达及对细胞周期的影响

目的　观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外培养的不同阶段小鼠晶状体上皮细胞(LECs)中的表达,及其对细胞周期的影响并探讨其机制。方法将昆明健康小鼠的晶状体前囊膜取出,做体外培养并传代。利用免疫组织化学法和Westernblot法检测bFGF在体外培养的不同阶段LECs中的表达情况,并利用流式细胞法检测相应阶段LECs的细胞周期情况。结果bFGF蛋白在LECs的原代、传第1、2代中明显表达,在传第3、4代中表达较弱。这与流式细胞法检测的细胞周期中有丝分裂相所占比例相符。结论bFGF参与LECs的增殖分化过程;并随着传代的递增,其促LECs增殖作用减弱,提示它与临床儿童后发性白内障发生率高有关。     

同源盒基因Pax-6在晶状体发育过程中的表达分析

目的 建立晶状体连续发育模型，检测Pax—6基因在小鼠晶状体发育的不同阶段的表达情况，探讨该基因在小鼠晶状体发育中的作用。方法 利用RT—PCR法和westernblot法，检测Pax—6在小鼠晶状体发育不同阶段中的表达状况。结果 在鼠胚9．5d(E9．5)即可检测到Pax—6的表达，在其连续发育阶段的E12．5，E17．5及新生10、20、60d均可检测到Pax—6的表达。westernblot法同样发现在体外培养的原代细胞，传第1、第2及第3代的晶状体上皮细胞(LECs)中均能检测到Pax—6蛋白水平的表达。结论小鼠晶状体发育的各个阶段均具有Pax—6基因，该基因的正常表达是晶状体发育的必要条件。     

NO-Fluvastain对体外培养的人LECs增生作用的实验研究

目的 研究NO-Fluvastain对体外培养的人晶状体上皮细胞(LECs)增生的影响及其作用机制.方法 用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增生;流式细胞仪测定细胞周期;RT-PCR测定细胞周期调控蛋白CyclinE mRNA和P21waf1 mRNA表达.结果MTI 检测显示NO-Fluvastain对体外人LECs的增生具有显著抑制作用,并且表现出时间和剂量依赖关系.流式细胞仪检测发现:NO-Fluvastain可阻滞人LECs由G0/G1期向S期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.RT-PCR检测发现:NO-Fluvastain可抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waft.mRNA表达.与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 NO-Fluvastain通过抑制CyclinE mRNA表达,促进P21waf1 mRNA表达,使人LECs阻滞于G0/G1期,从而抑制人LECs增生.     

bFGF在体外培养的正常人及白内障患者LECs中的表达

目的 体外培养正常人及白内障患者晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs),分别检测碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在体外培养的正常人及白内障患者LECs中的表达,以探讨bFGF在白内障患者LECs中的作用.方法 体外培养正常人及白内障患者LECs并传代;利用免疫组织化学法和免疫印迹法,检测bFGF在体外培养的正常人及白内障患者LECs不同阶段的蛋白水平的表达.结果 原代培养的正常人及白内障患者LECs无明显差异,但在传代过程中白内障患者的LECs出现了较早的细胞衰老现象;在正常人原代培养细胞和传代的LECs中检测不到bFGF的表达,或仅有微弱表达,而在白内障患者的原代培养细胞和传代的LECs中,bFGF的表达较正常人明显增多,并明确表达了相对分子质量为17 000的蛋白.结论 老年性白内障LECs相对正常LECs而言,生长缓慢,容易出现细胞衰老现象,且有丝分裂能力差;白内障患者术后残留的LECs引起损伤修复过程,合成并释放bFGF,造成LECs的增生、移行和纤维化,并可能成为后囊混浊的原因之一.     

ILK siRNA对高浓度葡萄糖诱导的人LECs增生和上皮向间质转化的抑制作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）对高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和转化的作用。方法将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中,用RT-PCR检测培养0、6、24h后ILK mRNA的表达;用ILK siRNA脂质体转染细胞,转染6h后,加入2组培养液处理24h,检测ILK、细胞增生核抗原（PCNA）、LECs转化指标α-SMA和FN在mRNA水平的表达。结果高糖组培养6h和24h,SRA01/04细胞ILK mRNA是正常对照组的2.48倍和2.32倍（P〈0.01）,刺激后24h,SRA01/04细胞PCNA、α-SMA、FN的mRNA表达分别是正常对照组的1.75、1.96和1.75倍（P〈0.01）。ILK siRNA干扰后,正常对照组ILK的表达是非转染细胞的30%,高糖组转染细胞ILK mRNA水平（P〈0.01）是非转染细胞的21%（P〈0.01）,转染细胞PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29%、33%和39%（P〈0.01）。结论高浓度葡萄糖可诱导LECs增生、上皮向间质转化及ILK表达上调,抑制ILK的高表达能阻止这些过程。     

衰老晶状体上皮细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的研究

目的 探讨体外培养品状体上皮细胞(LECs)的衰老情况以及衰老LECs对凋亡诱导因素的敏感性.方法体外培养兔LECs并传代.对第1、4、7代LECs进行研究,β-半乳糖苷酶组织化学染色检测衰老细胞,分析细胞衰老百分数的差异;原位末端标记法(TUNEL)检测培养过程中细胞的凋亡状况;10μmol/L喜树碱诱导细胞凋亡,比较各代细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的差异. 结果 LECs在体外培养过程中表现为有限生长的特性,经过增生、传代后衰老细胞增加.各代LECs在不受干预的情况下不发生凋亡.第1、4、7代LECs对喜树碱凋亡诱导因素的敏感性差异有统计学意义.结论 LECs在体外培养过程中表现为有限生长的特性,增生的细胞以衰老为结局,衰老的LECs在不受外界干扰的情况下不发生凋亡,但对凋亡诱导因素的敏感性增加.     

CTGF作用于体外培养牛晶状体上皮细胞的研究

目的观察结缔组织生长因子（CTGF）在体外培养牛晶状体上皮细胞（LECs）迁移和转分化中的作用。方法将体外培养的第2～3代牛LECs分为对照组和实验组,实验组分别经0.1×10^6、0.5×10^6、1.0×10^6ng/LCTGF处理24h后,采用半定量RT-PCR和Westernblot技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA以及蛋白表达的变化。迁移实验中,利用transwell小室对LECs的移行能力进行检测。结果与空白对照组相比,CTGF能够明显促进α-SMAmRNA以及蛋白的表达（F=66.56,P〈0.01;F=65.43,P〈0.01）。迁移实验发现,CTGF能够促进LECs的移行,与空白对照组相比差异有统计学意义（t=51.7,P〈0.01）。结论CTGF以剂量依赖的方式促进牛LECs的分化和迁移,可能在后囊膜混浊（PCO）的LECs移行、转分化以及细胞外基质沉积的过程中发挥重要作用。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子基因在胎儿与白内障患者晶状体上皮细胞内表达的比较

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子基因在胎儿和白内障患者晶状体上皮细胞内表达的区别。方法:采用原位杂交方法,用cDNA探针检测胎儿培养及组织切片中的晶状体上皮细胞和白内障患者前囊中的晶状体上皮细胞的bFGF的mRNA,并用图像分析进行相对定量,比较胎儿培养细胞、组织切片细胞及患者囊膜细胞的积分光吸收度值。结果:胎儿的培养及组织切片中晶状体上皮细胞和白内障患者前囊中的晶状体上皮细胞都存在bFGF基因表达。胎儿体外培养晶状体上皮细胞、胎儿组织切片晶状体上皮细胞和白内障患者晶状体上皮细胞积分光吸收度值分别为627.1±268.7,131.5±42.8和79.2±26.3。胎儿体外培养晶状体上皮细胞积分光吸收度值显著高于胎儿组织切片晶状体上皮细胞(P<0.01);白内障患者晶状体上皮细胞积分光吸收度值显著低于胎儿晶状体上皮细胞(P<0.01)。结论:晶状体上皮细胞体外培养可增加bFGF基因表达;胎儿晶状体上皮细胞bFGF基因表达显著高于白内障患者晶状体上皮细胞。     

Differences of bFGF gene expression in lens epithelial cells between fetuses and cataract patients

AIM: To study the differences of basic fibroblast growth factor (bFGF) gene expression in lens epithelial cells (LECs) between fetuses and cataract patients. · METHODS: In situ hybridization was used to detect bFGF mRNA in the LECs that were cultured and in tissue sections from fetuses and in the LECs from the anterior capsule of cataract patients. Image analysis was used for the relative quantitative analysis of bFGF mRNA. · RESULTS: bFGF gene existed in the LECs that were cultured and in tissue sections from fetuses and in the LECs from the anterior capsule of cataract patients. The integral absorbance for the fetal cultured cells, the fetal tissue sections and the capsule membrane cells of cataract patients were 627.1±268.7, 131.5±42.8 and 79.2±26.3 respectively. The integral absorbance of fetal cultured LECs was significantly higher than that of fetal section LECs (P <0.01). The integral absorbance of cataract LECs was significantly lower than that of fetal LECs (P <0.01). · CONCLUSION: The in vitro culture of LECs can improve bFGF gene expression. The bFGF gene expression in fetal LECs is significantly higher than that in cataract LECs.     

Downregulated expression of ADAM9 in anterior polar cataracts

PURPOSE: To determine whether ADAM (a disintegrin and metalloproteinase) is regulated in lens epithelial cells (LECs) of patients with anterior polar cataracts and by transforming growth factor (TGF)-beta 1 in cultured LECs. SETTING: Department of Ophthalmology and Visual Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. METHODS: Lens epithelial cells attached to the anterior capsules of human cataractous lenses with nuclear and anterior subcapsular cataracts and noncataractous lenses were analyzed by reverse transcribed-polymerase chain reaction for the expression of ADAMs. The effect of TGF-beta 1 on ADAM gene expression was also tested in mouse lens epithelial explants and cultured LEC lines (alpha TN-4 and HLE B-3). RESULTS: Significantly reduced expression of mRNA for ADAM9 was observed in LECs from patients with anterior polar cataracts. The expression of mRNA for ADAM9 was downregulated by TGF-beta 1 in cultured human LECs. Treatment of cultured mouse LECs with TGF-beta 1 led to a reduction in ADAM1 mRNA. CONCLUSIONS: ADAMs are expressed and regulated in LECs. The downregulated expression of ADAM9 may serve as a marker for anterior polar cataracts in addition to previously known proteins, fibronectin, alpha-SMA, and beta ig-h3. The functions of this protein in lens pathology require further investigation.     

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用,但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌,参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组,培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组,用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达,包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平,各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较,模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08,P〈0．叭）,而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组,差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06,P〈0．01）。与正常组比较,模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低,差异有统计学意义（t=1．86E一05,P〈O．01）,与模型组相比,水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高,差异有统计学意义（t=8．56E一05,P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤,rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。     

Extracellular matrixes influence alpha-smooth muscle actin expression in cultured porcine lens epithelial cells.

PURPOSE. To determine whether extracellular matrix (ECM) influences the expression of alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA), a marker for myofibroblasts, in cultured porcine lens epithelial cells (LECs). METHODS. Porcine LECs were cultured for 6 days in an F-12 nutrient mixture supplemented with 5% fetal bovine serum on wells that were coated with laminin, fibronectin, type I collagen, or type IV collagen. LECs cultured on uncoated wells served as a control. Alpha-SMA was detected immunocytochemically with a mouse monoclonal antibody, and the ratio of the number of alpha-SMA-positive cells to the total number of cells, the P/T ratio, was calculated. RESULTS. The P/T ratio of the LECs on the uncoated dishes was about 5%. LECs cultured on wells coated with laminin or type IV collagen significantly reduced the ratio, whereas fibronectin or type I collagen had no effect. CONCLUSIONS. The ECM influences alpha-SMA expression in cultured porcine LECs.     

卡配因Ⅱ在过氧化氢诱发大鼠白内障的晶状体上皮细胞中的表达

目的　探讨卡配因Ⅱ在过氧化氢 (H2 O2 )诱发大鼠白内障的离体晶状体上皮细胞中的表达改变和意义。方法　使用H2 O2 诱发实验组离体培养的大鼠晶状体发生白内障 ,用免疫组织化学方法检测卡配因Ⅱ在大鼠晶状体上皮细胞中的表达 ,与对照组正常晶状体上皮细胞中的卡配因Ⅱ表达进行比较 ,并进行统计学分析 ;观察 2个组晶状体出现混浊的时间和程度。结果　实验组大鼠的晶状体上皮细胞中卡配因Ⅱ的表达明显增高 ,与对照组比较 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 )。卡配因Ⅱ表达的增高发生于晶状体混浊之前。结论　H2 O2 可在大鼠晶状体上皮细胞中激活卡配因Ⅱ的表达 ,从而使其在氧化损伤诱发白内障的过程中发挥作用