液泡膜水通道蛋白γ—TIP表达载体的构建及其抗体的制备

利用PCR技术,从拟南芥（Arabidopsisthaliana（L．）Heynh．）液泡膜水通道蛋白γ－TIP的cDNA中扩增了含水通道特异保守区的205bp片段,并将其构入pGEX－KG原核表达载体。酶切、测序分析表明构建的重组质粒pGEX-TIP结构正确。0．4mmol/L的IPTG可诱导表达分子量为32kD融合蛋白GST-TIP,表达蛋白以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的50％。实验用SDS-PAGE制备电泳从菌体的超声裂解液中纯化了GST-TIP融合蛋白,以此融合蛋白为抗原制备了高质量的液泡膜水通道蛋白的抗体,为研究水通道蛋白在组织中的定位及生理功能提供了有用的蛋白探针。     

植物液泡膜水通道蛋白的结构、分布和功能研究进展

植物液泡膜水通道蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)是植物体内水分子和一些小分子溶质跨液泡膜运输的通道。TIPs介导胞内或胞间的水分跨膜运输,在维持植物细胞的水分平衡过程中起着至关重要的作用。由于TIPs特异的定位在液泡膜上,长久以来一直被用作不同植物物种和组织中液泡识别的标记物。本综述介绍了液泡膜水通道蛋白的发现、结构、分类以及亚细胞和组织定位、基因表达和蛋白功能等方面的研究进展,初步探讨了植物液泡膜水通道蛋白研究中存在的问题及今后的研究热点,希望能为相关的科研人员在研究液泡膜定位的水通道蛋白中提供帮助。     

植物膜水通道蛋白

活细胞含有80%以上的水分,水出入细胞和组织是生命代谢的基本过程。长期以来,普遍认为细胞中的水分子以简单的跨膜扩散方式透过脂双层膜。由于在一些研究中发现,生物膜的渗透水通透系数ｐｆ(Ｏｓｍｏｔｉｃｗａｔｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ)远远大于其扩散水通透系数ｐｄ(ｄｉｆｆｕｓｉｏｎａｌｗａｔｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ),因此一些学者推测水分子并不仅以单一的跨膜扩散方式透过生物膜。但是,许多学者对这一看法持不同意见,他们认为水分子在细胞内或细胞间的跨膜扩散速度足以满…     

寨卡病毒囊膜E蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达寨卡病毒(ZIKV)囊膜(E)蛋白的200个氨基酸(138～338)截短片段ZIKV-E~(200),制备其多克隆抗体,为寨卡病毒亚单位疫苗后续研究提供检测抗体。方法:用全基因序列合成方法合成寨卡病毒E蛋白全长基因,以该基因为模板,用PCR方法克隆ZIKV-E~(200)基因片段,经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后连接到pET22b载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET22b-ZIKV-E~(200),将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组表达菌株pET22b-ZIKV-E~(200)。将37℃诱导表达后的菌液超声波破碎处理后制备ZIKV-E~(200)蛋白,将制备的抗原ZIKV-E~(200)免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体,采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ZIKV-E~(200)基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pET22b-ZIKV-E~(200),在大肠杆菌中表达了重组ZIKV-E~(200)蛋白,其相对分子质量约为25 000,与理论值一致;用分离的蛋白ZIKV-E~(200)免疫小鼠后获得了抗ZIKV-E蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体检测到了酵母表达的寨卡病毒E蛋白。结论:ZIKV-E~(200)蛋白的多克隆抗体可用于酵母表达的寨卡病毒E蛋白的检测等研究。     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

PTD融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的：为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原恢表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础。方法：应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH（黄体生成激素释放激素）基因、TAT（HW—1反式转录激活因子）基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28α～LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni—NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体。结果：表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测．LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12．6％。LTA蛋白经Ni—NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清。结果表明抗体的效价为1：12800。结论：应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体。     

液泡膜苹果酸转运蛋白研究进展

液泡是植物细胞贮藏苹果酸重要的细胞器.苹果酸是三羧酸酸循环和乙醛酸循环的中介,是维持细胞渗透压与电荷平衡的关键代谢物,还参与调节植物气孔大小,故苹果酸在植物的生命活动中起着重要作用.液泡膜苹果酸转运蛋白直接或间接控制苹果酸进出液泡,介导液泡与细胞质问苹果酸的运输.液泡膜苹果酸转运蛋白属于钠连接的羧酸盐载体家族,本文重点介绍植物液泡膜苹果酸转运蛋白的性质和功能及其与植物细胞pH值动态平衡之间关系的研究进展.     

钙结合蛋白D-9K基因原核表达载体的构建、表达产物纯化及其多克隆抗体的制备

本研究构建了pBV220/CabpD-9k-βhCG表达质粒,在大肠杆菌TG-1中进行表达,得到了CabpD-9k-βhCG融合蛋白。SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为34.5KD。Western blot结果表明,融合蛋白与兔抗人hCGIgG特异结合。用纯化的融合蛋白免疫C57BL小鼠,制备了多克隆抗体,这为进一步研究钙结合蛋白D-9K在着床中的功能和子宫内膜Ca2+信号转导奠定了基础。     

水稻蔗糖转运载体蛋白(OsSUT2)非跨膜区域特征性序列的融合表达及其抗体制备

植物光合作用产生的蔗糖是植物生长发育的主要碳源物质,还是诱导植物生长发育过程中诸多相关基因表达的特异信号分子[1].蔗糖分子在植物器官及组织间的生理分配维持着整个植物体的正常生长发育[2].植物蔗糖转运载体(sucrosetransporter,SUT)是一类担负着蔗糖分子在细胞间的转运及信号转导的功能性蛋白家族,它在蔗糖的韧皮部装载、沿韧皮部的再吸收、韧皮部卸载和向库器官的转运等跨膜运输以及蔗糖特异信号感应过程中发挥着重要的生理功能[3～5].植物蔗糖转运载体蛋白分布于植物细胞质膜上,该转运载体蛋白含有12个疏水性跨膜结构域,在其氨…     

抗甜菜坏死黄脉病毒单链抗体表达载体的构建及其表达

用ＰＣＲ方法以分泌抗甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）单克隆抗体的杂交瘤细胞的基因组为模板,扩增了编码ＢＮＹＶＶ单抗的重链可变区（ＶＨ）基因。测序表明,该ＶＨ序列属于小鼠ＩＩ（Ａ）亚类,全长为３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸。将其和先前克隆的轻链基因分别插入到一个含有连接ＶＨ和ＶＬ基因的连接序列的质粒之中,构建成单链抗体（ｓｃＦｖ）基因的表达载体ｐＴＣｓｃＦｖ。将质粒在大肠杆菌中表达,ＥＬＩＳＡ法检测出     

His-FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建His标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA的融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中表达,为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础.方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌femA基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在引物的5'加入BamHI及SalI酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版,PCR扩增出femA基因片段.将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR、双酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-femA融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证.结果 经PCR、双酶切签定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA构建成功;重组质粒pQE30-femA转化大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53 kD目的蛋白;经Bandscan软件分析,目的蛋白质在4h的表达量占细胞总蛋白的27.5％.结论 成功构建了His-FemA原核表达载体(pQE30-femA),并在大肠埃希菌中高效表达.     

大鼠肝脏水通道蛋白7的表达

目的研究水通道蛋白7(AQP7)在大鼠肝脏中的表达和分布。方法选用成年健康SD大鼠,采用免疫组织化学的方法对肝脏中AQP7蛋白的表达进行定位检测。结果AQP7阳性免疫反应产物集中位于大鼠肝脏毛细胆管面的肝细胞质膜上,肝细胞的基膜面和血窦面未见阳性免疫反应产物。结论AQP7在肝脏中的表达及其空间上的分布提示其可能参与胆汁的分泌。     

水通道蛋白

水通道蛋白 (aquaporin,AQP)是对水专一的通道蛋白 ,普遍存在于动、植物及微生物中。它所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运 ,是水进出细胞的主要途径。1　水通道蛋白的发现长期以来 ,普遍认为细胞内外的水分子是以简单的跨膜扩散方式来透过脂双层膜。后来由于在生物物理学研究中发现红细胞及近端肾小管对渗透压改变引起的水的通透性很高 ,很难单纯以弥散来解释。因此 ,一些学者推测水的跨膜转运除了简单扩散外 ,还存在某种特殊的机制 ,并提出了水通道的概念。1988年 ,Agre等在鉴定人类 Rh血型抗原时 ,偶然在红细胞膜上发现了 1种新的 2…     

In-Fusion 技术构建Ⅰ型钠通道与绿色荧光蛋白融合表达及其突变载体

目的：构建Ⅰ型钠通道(Nav1.1)与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体及其突变载体。方法：利用In-Fusion 技术将SCN1A 基 因亚克隆到绿色荧光蛋白真核细胞融合表达载体（pAcGFP1-C In-Fusion Ready Linear Vector）。PCR 扩增SCN1A 基因（与线性载 体对应两端有15 个相同碱基）,In-Fusion 技术进行融合即得到pCMV-GFP-C-SCN1A。将其转染HEK293T 细胞,Western blot 检 测Nav1.1 的表达。定点诱变试剂盒对其进行定点诱变。结果：1.成功构建Nav1.1 与GFP 融合表达载体pCMV-GFP-C-SCN1A;2. DNA 测序表明：在预期位点已经发生突变,SCN1A 基因第190 位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA)。结论：Nav1.1 与 GFP 融合表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致Nav1.1 功能的改变奠定了基础。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

猪流行性腹泻病毒纳米抗体酵母表达载体的构建及其表达分析

[目的]探究猪流行性腹泻病毒纳米抗体SH-Fc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达情况,以期获得毕赤酵母表达系统,从而进一步研究PEDV的治疗方法.[方法]利用相关生物学分析软件对目的蛋白进行理化性质,磷酸化位点及二、三级结构的分析.将pUC57-SH-Fc质粒与酵母表达载体pPIC9K双酶切,构建真核表达载体pPIC9K-SH...     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

骨形成蛋白诱导型真核载体的构建及其表达

成骨分化相关基因骨钙素 (OC)等的启动子内均含有成骨特异性转录因子Cbfa1特异性作用元件 ,而骨形成蛋白 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)的促成骨分化作用正是通过其首先引起Cbfa1的升高 ,而后Cbfa1激活这些基因的表达 ,最终出现成骨分化表型 .为解决BMP没有理想的活性测定方法的问题 ,在RT PCR结果证实BMP 2可促进NIH3T3和C2C12细胞Cbfa1表达后 ,构建了串联6个Cbfa1作用元件的小鼠OC部分启动子 (6OCP)控制萤光素酶 (luciferase)报告基因的真核表达质粒 ,以期来放大BMP诱导报告基因表达的作用效果 .即通过细胞转染、rhBMP 2刺激后检测萤光素酶活性变化 ,从而间接定量测定rhBMP 2的生物学活性 .结果表明 ,pcDNA3 6OCP Luc转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3 Luc大为降低 ;而且在一定剂量范围内 ,转染细胞的萤光素酶活性 (荧光值 )随rhBMP 2剂量增加而升高 ,并呈线性正相关 ,为建立BMP活性定量测定的方法打下基础     

发菜NdhK的抗体制备与蛋白表达

发菜是一种陆生蓝藻,分布于一些干旱和半干旱区域。其NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO₂吸收、围绕光系统Ⅰ的循环电子传递和细胞呼吸。为研究该物种中ndhK基因的功能,本研究利用特异性引物,通过PCR方法从发菜中扩增ndhK基因并克隆到原核表达载体pET-32a上,得到表达载体pET-32a-ndhK,将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,得到分子量大小为43 kDa的融合蛋白NdhK。随后,采用亲和层析,对融合蛋白进行纯化回收,并以此回收蛋白作为抗原进行免疫,制备NdhK的多克隆抗体。最后,利用Western blot蛋白免疫印迹对所得抗体的特异性进行验证。从而为进一步探索发菜ndhK基因的功能以及发菜中NDH-1复合体各亚基的作用进行前期准备。