腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因杀伤人膀胱癌细胞的实验研究

目的探讨HSV-tk/GCV系统基因治疗膀胱癌细胞的方法及结果。方法与结果采用了带有CMV启动子驱动HSV-tk基因的重组腺病毒载体,体外转染HTB9细胞后对GCV敏感性增强。当MOI=100时,HTB9细胞的IC50为2.5mg/L,病毒浓度降低,GCV对细胞的杀伤效率亦降低。将不同比例的tk 细胞和tk-细胞混合后加入10mg/L GCV,发现HSV-tk/GCV系统有很强的“旁观者效应”。结论HSV-tk/GCV系统是一种有效、安全地治疗膀胱癌的新方法。     

大鼠降钙素基因相关肽重组腺病毒的构建与鉴定

目的利用AdMaxTM腺病毒载体系统,构建大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）基因重组腺病毒载体,包装重组腺病毒并鉴定。方法根据Genbank提供的大鼠CGRP序列信息（NM₀01033956.1）,合成序列全长,PCR方法扩增目的基因,将CGRP/His基因片段亚克隆至穿梭质粒pDC316,形成重组质粒pDC316-CGRP/His,挑选测序正确的质粒与骨架质粒pBHGloxdelE13cre共转染293A细胞,包装出重组腺病毒Ad-CGRP/His,利用PCR和Western鉴定基因的表达。结果 （1）成功构建pDC316-rCGRP/His重组质粒。（2）包装出表达rCGRP/His的重组腺病毒。结论成功构建携带大鼠CGRP基因的重组腺病毒载体,并获得表达rCGRP/His的重组腺病毒,为深入研究CGRP基因并开展相关的基因治疗研究奠定基础。     

NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定

目的 构建含有肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体，为应用HGF／NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法 应用AdEasy腺病毒载体系统，将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle-CMV进行连接，获得重组质粒pShuttle-CMV-NK4，将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5l83获得重组腺病毒质粒pAdCMV-NK4，用该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV-NK4。重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT-PCR、Western Blot等方法进行鉴定。结果 得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4，电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态，RT-PCR及Westem Blot分析显示rvAdCMV-NK4感染293细胞后NK4基因可有效转录并表达。结论 成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdcMV-NK4，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

重组人p53腺病毒提高胃癌细胞对顺铂敏感性的实验研究

目的：研究重组人p53腺病毒增加胃癌细胞对顺铂敏感性的作用。方法：重组人p53腺病毒感染胃癌细胞BGC-823，Western blot法检测p53蛋白在胃癌细胞中高表达；MTT法测定重组人p53腺病毒单独及联合顺铂用药的不同浓度处理细胞的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。结果：重组人p53腺病毒感染BGC-823 48h，p53蛋白在BGC-823中高表达，并产生G2／M期阻滞和细胞凋亡。重组人p53腺病毒联合顺铂用药增加顺铂的敏感性，有剂量时间的依赖性。结论：腺病毒介导p53基因感染BGC-823细胞诱导凋亡并增加胃癌细胞对顺铂的敏感性，为p53基因治疗与胃癌化疗临床结合提供了可靠的实验依据。     

重组人p53腺病毒治疗中晚期肝癌的毒副反应护理

重组人p53腺病毒(rAd-p53)是世界上第1个获准上市的肿瘤基因治疗药物,由复制缺陷性腺病毒载体和野生型p53基因组成。rAd-p53通过腺病毒感染肿瘤细胞把野生型p53基因带入肿瘤细胞内,表达的p53蛋白具有抗肿瘤作用。目前,rAd-p53已用于多种实体性恶性肿瘤,并成为     

介导hyrdC基因重组腺病毒对胃癌SGC-7901细胞生长影响的实验研究

目的观察介导hyrdC基因重组腺病毒对胃癌细胞生长的影响。方法将已构建的Ad-hyrdC重组腺病毒转染人胃癌SGC-7901细胞,并设置Ad-LacZ组以及空白对照组,免疫组化法检测hyrdC蛋白在胃癌SGC-7901细胞中的表达情况,采用绘制生长曲线法和MTT法观察和比较各组胃癌细胞的生长差异,将各组胃癌细胞接种裸鼠皮下构建裸鼠荷瘤模型以比较各组瘤体大小的差异。结果绘制生长曲线显示Ad-hyrdC组胃癌SGC-7901细胞生长显著增快,从48h后其细胞数与空白组以及Ad-LacZ组均有统计学差异(P<0.05),而Ad-LacZ组细胞与空白组无统计学差异(P>0.05);Ad-hyrdC组细胞MTT值显著高于Ad-LacZ组以及空白组(P<0.05),Ad-LacZ组与空白组无统计学差异(P>0.05);而Ad-hyrdC组胃癌瘤体与Ad-LacZ组及空白组胃癌荷瘤模型瘤体大小之间无统计学差异(P>0.05)。结论 hyrdC基因具有促进胃癌细胞生长的功能,hyrdC基因有可能成为胃癌基因治疗领域的新靶点。     

重组腺病毒r-caspase3的靶向性实验研究

目的:观察构建靶向性反向半胱氨酸蛋白酶3(r-caspase3)重组腺病毒对AFP表达阳性肝癌细胞凋亡诱导的效果和特异性.方法:采用AFP表达强阳性细胞HepG2、表达弱阳性细胞7721、正常肝细胞L-02以及AFP表达阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231,分别感染构建之重组腺病毒Ad-r-caspase3、Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3及Ad-P(ALB)/r-caspase3,SRB染色测定O.D值,计算细胞死亡率和IC50;流式细胞术检测细胞凋亡指数.结果:HepG2、7721细胞对各腺病毒敏感程度为Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3>Ad-PALB/r-caspase3>Ad-r-caspase3;流式细胞术检测结果显示重组腺病毒Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3具有极强的凋亡选择性,AFP表达越强,凋亡指数越高.结论:靶向性 Ad-E(AFP)-P(ALB)/r-caspase3重组腺病毒具有肝细胞性肝癌凋亡选择性,同AFP表达呈正相关.     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景:腺病毒载体作为低毒高效的基因载体己被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见.目的:构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法:采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度.结果与结论:观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验己成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体.     

乳腺癌的基因治疗研究

乳腺癌的发生、发展是一个复杂的过程,涉及多种基因的改变。随着越来越多的乳腺癌相关基因被确认,基因治疗成为乳腺癌治疗的一个新途径和研究热点。乳腺癌基因治疗的方法主要有癌基因治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、自杀基因治疗、抗血管生成治疗、miRNA治疗、联合基因治疗等。     

细菌内同源重组构建含人内皮抑素基因腺病毒及在胃癌细胞中的体外转染实验

目的 :采用细菌内同源重组法构建含人内皮抑素基因的重组腺病毒Ad -CMV -hEn。方法 :将hEn基因自 pCA13-hEn质粒中酶切下来 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 pAdtrack -CMV -hEn ,并用PmeⅠ线性化后与腺病毒基因组质粒 pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5 183,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA ,PacⅠ酶切后在 2 93细胞中包装成腺病毒颗粒。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,同时测定了病毒滴度。并采用RT -PCR检测感染腺病毒的胃癌细胞内有无hEnmRNA的转录。结果 :由 pAdtrack -CMV -hEn和pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5 183后 ,可得到阳性重组体细菌克隆 ,包装完成的腺病毒经PCR检测表明已含有hEn基因。纯化所得腺病毒滴度约为 2 .4× 10 11pfu /ml。RT -PCR证实在感染重组体腺病毒Ad .CMV -hEN的细胞中有相应mRNA的转录。结论 :细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所构建的Ad -CMV -hEn在体外能有效转录相应的mRNA。     

Enhancement of Adenovirus Delivery after Ultrasound-Stimulated Therapy in a Cancer Model

Improving the efficiency of adenovirus (Ad) delivery to target tissues has the potential to advance the translation of cancer gene therapy. Ultrasound (US)-stimulated therapy uses microbubbles (MBs) exposed to low-intensity US energy to improve localized delivery. We hypothesize that US-stimulated gene therapy can improve Ad infection in a primary prostate tumor through enhanced tumor uptake and retention of the Ad vector. In vitro studies were performed to analyze the degree of Ad infectivity after application of US-stimulated gene therapy. A luciferase-based Ad on a ubiquitous cytomegalovirus (CMV) promoter (Ad5/3-CMV-Luc) was used in an animal model of prostate cancer (bilateral tumor growth) to evaluate Ad transduction efficiency after US-stimulated therapy. Bioluminescence imaging was employed for in vivo analysis to quantify Ad infection within the tumor. In vitro studies revealed no difference in Ad transduction between groups receiving US-stimulated therapy using high, low or sham US intensity exposures at various multiplicities of infection (MOIs) (p = 0.80). In vivo results indicated that tumors receiving US-stimulated therapy after intra-tumoral injection of Ad5/3-CMV-Luc (1 × 10⁶ plaque-forming units) exhibited a 95.1% enhancement in tumor delivery compared with control tumors receiving sham US (p = 0.03). US-stimulated therapy has significant potential to immediately affect Ad-based cancer gene therapy by improving virus bioavailability in target tissues.     

超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。     

抗新生血管形成基因治疗胶质瘤的实验研究

目的:探讨Endostatin基因(EScDNA)对大鼠胶质瘤的抑制作用。方法:采用脂质体法将pSecTagA-ES-cDNA和pSecTagA转染人脐静脉内皮细胞(EVC-304),并以 RT-PCR、Western Blot分别从RNA水平和蛋白水平鉴定转染是否成功。然后以 FCM测细胞凋亡情况,MTT实验测细胞活力,验证Endostatin基因对血管内皮细胞增殖的抑制作用。再以C_6胶质瘤细胞植于SD大鼠腋部皮下制作胶质瘤模型。将pSecTagA-EScDNA直接瘤内注射。分别观察记录肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。结果:转染细胞PCR、Western分别检测到EScDNA和ES;FCM示细胞凋亡增加,MTT示细胞活力降低,肿瘤生长曲线示肿瘤生长明显受抑。说明Endostatin基因体内应用,具有明显抑制C_6胶质瘤的效应。结论:Endostin基因可能通过抑制肿瘤血管新生从而对胶质瘤达到抑制作用,为临床抗血管形成基因治疗胶质瘤提供了实验依据。     

肝动脉栓塞化疗加微波凝固疗法综合治疗肝癌

目的评估肝动脉栓塞化疗(TACE)加经皮微波凝固疗法(PMCT)综合治疗肝癌的疗效。方法以30例单纯肝动脉栓塞化疗组(TACE组)为对照组,30例肝动脉栓塞化疗加超声引导下微波凝固治疗组(TACE PMCT组)为综合治疗组,分别对比、观察两组疗效。结果1、2年复发率综合治疗组分别为26.32%、68.42%,对照组分别为68.18%、95.45%,P<0.05,原位复发率综合治疗组10%,对照组36.67%,P<0.05。1、2、3年生存率综合治疗组分别为96.67%、76%、56%,对照组分别为93.3%、39.3%、15.61%,P<0.05。两组患者治疗后均有ALT轻度增高,AFP明显下降,但统计学显示两组间无明显差异。结论TACE PMCT综合治疗肝癌方法简便,疗效确切,能降低肝癌患者复发率,提高生存率,值得临床进一步研究应用。     

肝细胞生长因子基因治疗减轻胆管结扎肝纤维化的实验研究

目的:验证肝细胞生长因子(HGF)基因治疗在胆管结扎肝纤维化中的保护作用。方法:用雄性CD-1小鼠,随机分为3组。正常对照组仅解剖肝门分离胆总管,不作胆管结扎;胆管结扎的2组,分别给予HGF质粒(pCMV-HGF,1μg/g)和空质粒(pcDNA3),每2周1次。3个月后将小鼠处死,评价肝纤维化程度。结果:肝细胞生长因子基因治疗能显著减少胆管周围胶原的沉积,表现在:肝胶原染色(Masson-Trichrome染色)减少;胆管周围Ⅰ型和Ⅲ型胶原的免疫荧光染色减少。和空质粒组相比,HGF治疗组肝组织羟脯氨酸的含量显著降低(两组分别为0.48±0.04μg/mgvs1.37±0.06μg/mg,P<0.05);肝纤维母细胞的激活减少——表现为肝组织中α-SMA的表达减少(两组分别为0.32±0.05vs.0.84±0.14,P<0.05);TGF-β1的表达减少(两组分别为0.69±0.11vs.1.31±0.23,P(0.01)。结论:在胆管结扎肝纤维化中,肝细胞生长因子基因治疗能减轻肝纤维化的程度,肝细胞生长因子可用于肝纤维化的治疗。     

合并糖尿病对转移性肝癌介入治疗安全性及疗效的影响

目的：评估糖尿病对转移性肝癌患者行经动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization,TACE）的安全性及疗效的影响。方法：对临床诊断明确的54例转移性肝癌合并糖尿病患者（A组）及62例转移性肝癌无糖尿病患者（B组）的术前空腹血糖（其中A组每天术前均检测3餐前血糖,并通过口服降糖药、皮下注射或静脉滴注胰岛素将血糖控制在安全范围）、术后严重的并发症（包括肝脓肿、肝性脑病、糖尿病酮症酸中毒、低血糖等）发生情况、平均介入治疗次数、住院时间、平均可介入治疗期进行比较分析。结果：A组术前空腹血糖均值为（8.2±3.1）mmol·L-1,B组术前空腹血糖均值（4.5±1.4）mmol·L-1（P〈0.001）。平均介入治疗次数A组（6.3±2.1）次,B组为（9.5±2.8）次（P〈0.05）。平均住院时间A组为（11.2±3.5）d,B组为（7.8±2.6）d（P〈0.05）。平均可介入治疗期A组为（18.6±6.2）个月,B组为（23.5±4.5）个月（P〈0.05）。肝脓肿发生率A组为5.6%,B组为1.6%,经穿刺引流及抗感染药物治疗后好转。A组发生低血糖2例,肝性脑病2例,经积极治疗后好转。结论：糖尿病是影响转移性肝癌安全性及治疗疗效的一个重要因素。如果将血糖控制至安全范围内,预先去除糖尿病相关危险因素,结合血糖情况调整介入化疗栓塞方案,转移性肝癌合并糖尿病患者行TACE治疗是安全可行的。