粟酒裂殖酵母原生质体的制备及再生的研究

粟酒裂殖酵母原生质体的制备及再生的研究张明,王元君,潘仁瑞（中国科学技术大学生物系合肥２３００２６）制备微生物细胞原生质体是融合技术的先决条件,已在酵母菌品种改良的研究上发挥了很大作用（‘－‘）。此外,还可以广泛地用于诱变育种和导入外源基因以改变菌种...     

外源钙调素对粟酒裂殖酵母细胞增殖的影响

外源钙调素（ＣａＭ）对粟酒裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）细胞增殖的影响。实验结果表明外源ＣａＭ能明显抑制粟酒裂殖酵母细胞的增殖,其作用方式是延长了粟酒裂殖酵母细胞生长的延滞期,抗粟酒裂殖酵母ＣａＭ抗体,ＴＦＰ及Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ能降低ＣａＭ对细胞生长的抑制作用,而Ｃａ＾２＋及Ｃａ＾２＋螯合剂ＥＧＴＡ对ＣａＭ的抑制作用均无影响。以上结果提示,外     

粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制研究

粟酒裂殖酵母中PPR蛋白在线粒体和叶绿体的RNA代谢中起重要作用,ppr基因的缺失会引起线粒体功能异常(ppr5除外)。旨在揭示粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制。利用含有半乳糖的培养基分别培养WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10,观察野生型和突变体的生长表型;通过添加不同的金属离子及改变细胞表面pH来探究诱导这类突变体出现絮凝的因素;采用RT-PCR技术检测缺陷菌中编码细胞表面絮凝因子及细胞壁重构酶基因的表达情况。研究结果表明:ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除会引起由Ca²⁺依赖型半乳糖结合蛋白参与的细胞絮凝;不同的pH和不同金属离子对这些缺陷菌的细胞絮凝有影响;ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失会使细胞内编码絮凝因子和细胞壁重构酶基因表达上调。线粒体功能异常会诱导絮凝基因表达上调和细胞壁属性发生改变,从而产生絮凝现象。     

外源钙调素对粟酒裂殖酵母细胞增殖的影响

外源钙调素（CaM）对粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）细胞增殖的影响。实验结果表明外源CaM能明显抑制粟酒裂殖酵母细胞的增殖,其作用方式是延长了粟酒裂殖酵母细胞生长的延滞期。抗粟酒裂殖酵母CaM抗体、TFP及Phenyl-SepharoseCL－4B能降低CaM对细胞生长的抑制作用,而Ca2+及Ca2+螫合剂EGTA对CaM的抑制作用均无影响。以上结果提示,外源CaM对粟酒裂殖酵母细胞增殖的抑制作用可能是由于胞外CaM激活了细胞膜上的Ca2+泵,使胞内Ca2+浓度降低所致。     

粟酒裂殖酵母染色体DNA的脉冲电泳分析

采用等高锁状均质电场（ＣＨＥＦ）凝胶电泳技术,对来自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的粟酒裂殖酵母菌株ＡＳ２．２１４进行染色体ＤＮＡ分析。ＣＨＥＦ电泳结果显示菌株ＡＳ２．２１４的４条染色体ＤＮＡ的分子大小分别约为５９００ｋｂ、３２００ｋｂ、２５００ｋｂ和５５０ｋｂ,基因组大小约为１２０００ｋｂ。供试菌株ＡＳ２．２１４第Ｉ条染色体ＤＮＡ为５９００ｋｂ与已研究报道的菌株９７２ｈ＾－和ＨＭ２４８（     

胞外Ca^2＋促进粟酒裂殖酵母细胞增殖作用的研究

研究了胞外Ｃａ＾２＋粟酒裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）细胞增殖的影响,实验结果首次证明胞外Ｃａ＾２＋能明显促进粟酒裂殖酵母的增殖,其作用方式主要是缩短了粟酒裂殖酵母的生长延滞期,当起始的接种细胞密度升高至使粟酒裂殖酵母的生长滞期消失时,外加Ｃａ＾２＋的作用也消失,ＥＧＴＡ可抑制粟酒裂殖酵母的细胞增殖,而外加Ｃａ＾２＋能够有效消除ＥＧＴＡ的抑制作用,进一步说明胞外Ｃａ＾     

Ca^2＋在粟酒裂殖酵母细胞周期时相中的作用

以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)为研究材料,研究了Ca^2 在细胞周期时相中的作用,当外源Ca^2 浓度在0.5-20mmol/L范围内,随Ca^2 浓度增加,细胞增殖速度加快,延滞期逐渐缩短,但SD-Ca(CaCl2省略）并不能终止Sch.pombe的细胞周期。采用缺氮对群体细胞进行同步化,并以EGTA螯合培养介质中低浓度的Ca^2 ,Sch.pomdbe细胞增殖被完全抑制。细胞流式法测定结果表明：细胞周期被终止在G1期,分析认为Ca^2 对Sch.pombe细胞增殖是必不可少的,外源Ca^2 在G1期向S期转化过程中起着关键性的作用。     

Ca~(2+)在粟酒裂殖酵母细胞周期时相中的作用

以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为研究材料,研究了Ca~(2+)在细胞周期时相中的作用。当外源Ca~(2+)浓度在0.5-20 mmol/L范围内,随Ca~(2+)浓度增加,细胞增殖速度加快,延滞期逐渐缩短。但SD-Ca（CaCl2省略）并不能终止Sch. pombe的细胞周期。采用缺氮对群体细胞进行同步化,并以EGTA 螯合培养介质中低浓度的Ca~(2+),Sch. pombe 细胞增殖被完全抑制,细胞流式法测定结果表明：细胞周期被终止在G1期。分析认为Ca~(2+) 对Sch. pombe 细胞增殖是必不可少的,外源Ca~(2+)在G1期向S期转化过程中起着关键性的作用。     

酿酒酵母和粟酒裂殖酵母细胞增殖对Ca^2＋依赖性的比较研究

Under the same experimental conditions, exogenous Ca2+ had no effect on the proliferation of S. cerevisiae, but it could obviously stimulate the proliferation of S. pombe. Ca2+ chelator EGTA had no inhibition effect on the proliferation of S. cerevisiae, but it apparently inhibited the proliferation of S. pombe and the inhibition could be effectively overcome by adding Ca2+. Non-special ion chelator EDTA could inhibit the proliferation of both S. cerevisiae and S. pombe, but the inhibition could not be overcome by adding Ca2+. The results above directly showed that the dependence of the proliferation of the two kinds of yeast on exogeneous Ca2+ was different. The growth rate of S. cerevisiae was about 3 times that of S. pombe and the proliferation of S. cerevisiae was independent on the exogenous Ca2+, which was similar to transformed cells. Therefore, in order to understand the relationship between the disorder of cell cycle and cell transformation, it was very important to study the mechanism of different effects of exogenous Ca2+ on the proliferation of the two kinds of yeast.     

粟酒裂殖酵母中指示线粒体形态的荧光标签的构建

粟酒裂殖酵母是优秀的研究线粒体模型机理的模式生物.为建立适合粟酒裂殖酵母的指示线粒体形态的荧光标签,本研究以pYJ19质粒为骨架,构建了由粟酒裂殖酵母nmt41启动子控制的、以增强型绿色荧光EGFP为报告基因、以粟酒裂殖酵母自身蛋白Cox4为线粒体定位序列(Mitochondrial targeting sequences)来源的mts和以leu1营养为选择标记的质粒系统pMTS7.将pMTS7转化粟酒裂殖酵母yHL6381,以Mito-Tracker线粒体染料为对照,荧光显微镜观察结果发现,pMTS7能够与MitoTracker共定位,能正确显示线粒体定位.与具有一定毒性且染色结果不易控制的MitoTracker相比,利用pMTS7标记线粒体可以在显微镜下长时间观察清晰的线粒体形态,而且可以看到线粒体分裂融合的动态变化.pMTS7的成功构建为研究粟酒裂殖酵母中线粒体相关基因的突变体提供了技术工具.     

粟酒裂殖酵母全基因组中含信号肽蛋白质的研究

对粟酒裂殖酵母全基因组3条染色体上的4,997个蛋白序列进行了全局性的分析,利用signalP3.0软件分析这些蛋白的N-末端信号肽序列, 预测有N-末端分泌信号肽序列的蛋白196个;利用TMpred 软件分析跨膜结构, 预测跨膜蛋白117个; 使用PrositeScan程序分析膜脂蛋白的脂结合位点, 预测有膜脂结合蛋白13个, 进而预测分泌性蛋白序列66个。使用Target P分析66个分泌蛋白的蛋白序列, 研究这些蛋白在细胞中的定位。这些分泌蛋白的功能涉及粟酒裂殖酵母的营养、生殖、细胞间以及细胞与环境间的交流等许多方面, 对细胞的生存和繁殖有重要意义, 在系统生物学的研究中有重要参考价值。粟酒裂殖酵母分泌组的研究也将为粟酒裂殖酵母作为药物筛选模型以及开发为外源蛋白表达的宿主提供基础。     

胞外Ca~(2 )促进粟酒裂殖酵母细胞增殖作用的研究

研究了胞外Ca~(2 )对粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）细胞增殖的影响。实验结果首次证明胞外Ca~(2 )能明显促进粟酒裂殖酵母的增殖,其作用方式主要是缩短了粟酒裂殖酵母的生长延滞期。当起始的接种细胞密度升高至使粟酒裂殖酵母的生长延滞期消失时,外加Ca~(2 )的作用也消失。EGTA可抑制粟酒裂殖酵母的细胞增殖,而外加Ca~(2 )能够有效消除EGTA的抑制作用,进一步说明胞外Ca~(2 )是粟酒裂殖酵母增殖所必需的。此外,外加EGTA除了可延长细胞增殖的延滞期外,还能显著降低指数期细胞分裂的速率以及达到稳定期时培养液中的细胞总数,提示缺Ca~(2 )还影响粟酒裂殖酵母细胞的分裂。     

粟酒裂殖酵母染色体DNA的脉冲电泳分析

采用等高锁状均质电场（CHEF）凝胶电泳技术,对来自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）菌株AS2.214进行染色体DNA分析。CHEF电泳结果显示菌株AS2.214的4条染色体DNA的分子大小分别约为5900kb、3200kb、2500kb和550kb,基因组大小约为12000kb。供试菌株AS2.214第Ⅰ条染色体DNA为5900kb与已研究报道的菌株972h和HM248（5700kb）的基本一致,第Ⅱ条染色体DNA（3200kb）和第皿条染色体DNA（2500kb）,分别较上述2个菌株约小1400kb和1000kb,第Ⅳ条染色体DNA的分子大小与部分非整倍体菌株HM248的极微染色体Ch16DNA相近（500kb）。研究结果表明粟酒裂殖酵母菌株间染色体DNA长度存在显著差异,菌株AS2.214可能是三倍体减数分裂所产生的稳定的部分非整倍体。     

粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL21表达不足引发细胞粘附

【目的】随机选择裂殖酵母核糖体蛋白RPL21作为研究对象,分析其表达不足对细胞的影响。【方法】通过同源臂交换的方法,敲除裂殖酵母基因组中RPL21蛋白的编码基因rpl21-1和rpl21-2,观察突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内的核糖体合成情况以及细胞表型变化。【结果】突变菌株rpl21-1Δ和rpl21-2Δ细胞内总的rpl21(rpl21-1+rpl21-2)表达水平与野生型菌株相比分别减少了66.5%和58.7%,合成的核糖体总量较野生型菌株分别下降了62.8%和50.4%。突变菌株在YEPD液体培养基中培养时发生细胞粘附现象,而基因回补的重组菌株rpl21-1Δ/RPL21-1和rpl21-2Δ/RPL21-2突变株细胞中粘附现象消失。【结论】核糖体蛋白损伤造成核糖体合成受阻,进而引发细胞生长过程中的粘附在粟酒裂殖酵母中是普遍存在的现象。     

Ca2+在粟酒裂殖酵母细胞周期时相中的作用*

以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为研究材料,研究了Ca²⁺在细胞周期时相中的作用。当外源Ca²⁺浓度在0.5-20 mmol/L范围内,随Ca²⁺浓度增加,细胞增殖速度加快,延滞期逐渐缩短。但SD-Ca（CaCl₂省略）并不能终止Sch. Pombe的细胞周期。采用缺氮对群体细胞进行同步化,并以EGTA 螯合培养介质中低浓度的Ca²⁺,Sch. Pombe 细胞增殖被完全抑制,细胞流式法测定结果表明：细胞周期被终止在G1期。分析认为Ca²⁺ 对Sch. Pombe 细胞增殖是必不可少的,外源Ca²⁺在G1期向S期转化过程中起着关键性的作用。     

酿酒酵母和粟酒裂殖酵母属间融合和融合子特性

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)PW218和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Lindn)PW232的原生质体用20mmol/L CaCl_2和30％PEG(MW6000)处理进行属间融合,获得了10多株融合子,融合率为0.65～1.96×10~(-5)。对F_2和F_(10)两株融合子进行了葡萄糖、木糖及葡萄糖和木糖混合液的摇瓶实验结果表明F_(10)融合子利用葡萄糖、木糖及两种糖混合液产乙醇的能力大大高于两亲株。F_2融合子对木糖以及葡萄糖和木糖混合液的发酵能力亦较两亲株高,其中利用木糖产乙醇的量分别比PW218和PW232提高1.38倍和2.65倍。     

离子束诱变粟酒裂殖酵母产辅酶Q10的初步研究

辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ)对心脏充血性病人有较好的疗效,是临床常用药物之一.实验研究了离子束诱变粟酒裂殖酵母对提高CoQ10的产量的影响与作用.实验筛选出六株突变菌株,研究了突变株生理生化特性.结果表明:突变菌株的CoQ10产量都有不同程度的提高,其中编号为N1菌株产量达6.9344 mg/L,是对照菌株的10倍多,最低的N2菌株的产量也是对照菌株的1.3倍.     

TFP促进粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) 细胞增殖机理的探讨

采用激光扫描共聚焦显微镜观察的方法,以Fluo-3负载Schizosaccharomyces pombe细胞,荧光强度反映胞质游离Ca^2 浓度,结果表明,在无钙培养基中生长的S．Pombe沈胞内游离Ca^2 浓度低于在含10μmol／L外钙培养基中的S．pombe细胞,而一定浓度三氟拉嗪(TFP)处理过的S．pombe胞内游离钙浓度则有明显增加;用与TFP在对酵母质膜ATPase活性有拮抗效应的无机硫酸盐处理S.pombe细胞,发现可抑制其增殖,通过原子吸收光谱法测得胞内游离钙含量降低。因此认为TFP通过作用于质膜、促进Ca^2 内流刺激裂殖酵母细胞的增殖。     

某些金属离子对酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的细胞增殖具有不同的作用…

由于配制培养液所用试剂污染的金属离子已能满足酵母细胞生长需要,本文采用金属离子蟹合剂ＥＤＴＡ去除自由离子,然后回加某些金属离子方法研究了这些金属离子对酵母细胞增殖的影响,结果发现某些金属离子对Ｓ．ｐｏｍｂｅ和Ｓ．ｃｅｒｅｉｓｉａｅ的细胞增殖具有不同的作用效应。