草地螟普通气味结合蛋白I(Lsti-GOBP1)蛋白表达纯化及结合特性分析

气味结合蛋白在昆虫对寄主挥发性气味识别过程中有着重要的生理功能.本研究通过对草地螟Loxostege sticticalis L.普通气味结合蛋白I(Lsti-GOBP1)进行克隆及原核表达的基础上,分离纯化得到体外重组的Lsti-GOBP1 蛋白.并利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针研究了Lsti-GOBP1蛋白与醇类、醛类、酯、烯等50种气味标样的结合特性,结果表明Lsti-GOBP1可与其中35种气味化合物结合,但只有1-己醇、1-庚醇、肉桂醛和莰烯4种气味标样能在20 mol/L浓度(探针与蛋白结合的饱和浓度值)下将1-NPN从Lsti-GOBP1中替换50%,其结合常数分别为8.997,7.283,7.289和9.814 mol/L.据此可以得出,Lsti-GOBP1蛋白的气味物质结合谱很广,同时具有较强的特异性,其中1-己醇、1-庚醇、肉桂醛、莰烯等化合物在草地螟识别寄主植物气味物质的过程中起重要作用.     

家蚕化学感受蛋白BmCSP4表达谱及结合特性分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫体内存在的一类主要识别和运载非挥发性的气味分子和化学刺激物的可溶性蛋白。本研究运用半定量RT-PCR方法分析了BmCSP4的时空及组织表达谱。结果表明： BmCSP4在家蚕Bombyx mori各发育阶段均表达, 但表达量从4龄到蛹期逐渐减少, 且在雌成虫头部、 胸部和腹部表达量较少。用1-NPN作为荧光探针, 测定了15种外源配基与BmCSP4蛋白的结合特性, 结果显示： 仅芳香醛类和芳香酮类化合物在浓度10 μmol/L能将1-NPN从BmCSP4中替换50%, 苯甲醛解离常数为3.20 μmol/L, 对甲氧基苯甲醛解离常数为2.24 μmol/L, 2-戊基-3-苯丙基-烯醛解离常数为2.88 μmol/L, 1-苯基-1-丁酮解离常数为2.04 μmol/L, 苯乙酮解离常数为2.52 μmol/L。据此推测, BmCSP4在不同的发育阶段执行不同的生理功能, 并可能参与对芳香醛、 芳香酮类气味识别过程。     

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP7的表达及气味结合特性

气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs) 在昆虫嗅觉识别中起着重要的作用, 尤其是在运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)的过程中发挥关键作用。明确OBPs在昆虫同外界进行信息交流过程中的作用有利于阐明昆虫嗅觉识别的机制, 同时可为利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治奠定理论基础。本研究克隆了一个绿盲蝽Apolygus lucorum (Meyer-Dür)气味结合蛋白AlucOBP7基因（GenBank登录号: JQ675724）, 并进行了原核表达, 以1-NPN为荧光探针采用荧光竞争结合实验研究了AlucOBP7蛋白和10种棉花挥发物及 6种性信息素类似物的结合能力。结果表明： 在10种棉花挥发物中, AlucOBP7能够和2 己酮及水杨酸甲酯有效结合, 结合常数分别为55.13 μmol/L和28.26 μmol/L。在6种盲蝽性信息素类似物中, 4-氧代-反-2-己烯醛和AlucOBP7 具有较强的结合能力, 结合常数为23.14 μmol/L。丁酸乙酯、 丁酸丁酯及己酸己酯也能够和AlucOBP7 有效结合, 但结合能力中等, 结合常数分别为30.58, 39.26和35.81 μmol/L。初步推测, AlucOBP7 可能是绿盲蝽性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs), 并在感受性信息素和植物挥发物的过程中发挥双重功能。     

中华蜜蜂性信息素结合蛋白ASP1的原核表达及配基结合特性分析

【目的】研究中华蜜蜂Apis cerana cerana信息素结合蛋白ASP1与蜜蜂信息素及某些植物挥发物分子的结合功能。【方法】构建中蜂ASP1的原核表达载体, 对其进行重组蛋白的诱导表达和分离纯化, 并得到具有生化活性的中蜂ASP1重组蛋白, 最后以1-NPN作为荧光报告探针, 通过荧光竞争结合实验研究中蜂重组ASP1蛋白与蜜蜂信息素及其他气味分子的结合功能。【结果】在22种潜在信息气味物质中, 有7种与中蜂ASP1有较强的结合能力, 能将1-NPN的相对荧光强度降至50%以下。其中发现蜂王信息素两种成分对 羟基苯甲酸甲酯和香草醇的竞争能力最强, 可分别引起1-NPN相对荧光值下降99.31%和95.50%, 解离常数K_D分别为13.39和98.44 μmol/L; 而与除蜂王信息素外的其他信息素如幼虫信息素和工蜂信息素等分子均不结合。此外中蜂ASP1对于水杨酸甲酯、 苯乙醛、 3, 4-二甲基苯甲醛4-烯丙基藜芦醚和β-紫罗兰酮等5种植物挥发物质能产生强度不一的结合。【结论】中蜂信息素结合蛋白ASP1对蜂王信息素具有非常强的特异性, 同时也能结合某些植物挥发性气味分子, 暗示中蜂ASP1是一种以蜂王信息素识别为主要功能、 植物挥发物识别为次要功能的多功能信息素结合蛋白。     

桔小实蝇气味结合蛋白BdorOBP2的cDNA克隆、组织表达及配基结合特性

为了研究桔小实蝇Bactrocera dorsalis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)参与其嗅觉识别过程中的功能及其与植物气味的结合特性, 本研究克隆了桔小实蝇的一个气味结合蛋白基因, 命名为BdorOBP2（GenBank登录号为KC773766）, 并对该基因进行了原核表达。BdorOBP2开放阅读框长447 bp, 编码148 个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。定量PCR结果显示, 桔小实蝇BdorOBP2在不同组织中均有表达, 其中头部中的表达量最高, 翅中表达量最低（为头部表达量的63%±6%）。构建了BdorOBP2原核表达载体, 诱导并获得了重组BdorOBP2并进行了亲和层析纯化。最后以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）为荧光探针, 利用荧光竞争结合实验测定了重组BdorOBP2与7种主要寄主水果气味物质的结合能力, 发现其对多数酯类和醛类化合物亲合力较强, 亲合力最强的气味物质为反-2-己烯醛和β-紫罗兰酮, 结合常数KD分别为9.96和15.37 μmol/L。本研究结果可为高效地开发和设计桔小实蝇的嗅觉引诱剂配方提供一定的理论依据和参考。     

中华蜜蜂化学感受蛋白AcerCSP3的配基结合功能分析

为研究中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白AcerCSP3在化学感受系统中的生理功能, 本实验通过对AcerCSP3进行原核表达、分离纯化后, 利用荧光法研究了体外重组AcerCSP3与1-NPN以及候选化学配基的结合特征。Scatchard方程显示AcerCSP3与1-NPN的解离常数K_D为8.29 μmol/L, 结合位点数约等于1。在候选配基竞争1-NPN与AcerCSP3结合的实验中, 5种配基均能在200 μmol/L浓度下使1-NPN的相对荧光强度下降至50%以下, 其中β-紫罗兰酮甚至能使1-NPN的相对荧光强度下降至10%左右, 表明候选配基均与AcerCSP3有较强的结合能力, 而3, 4-二甲基苯甲醛与中蜂AcerCSP3的结合能力最强, K_D达到18.77 μmol/L。本研究所用化学配基均为植物花与叶片的挥发性的次生代谢产物, 表明AcerCSP3可能作为中蜂化学感受系统的一部分, 在其搜寻某些植物花粉蜜源时作为气味分子运载体发挥一定的作用。     

苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2结合特性初步分析

昆虫具有灵敏的嗅觉系统,能够特异性地识别性信息素和寄主挥发物来进行寻找配偶、定位寄主植物和产卵位点.气味分子结合蛋白在昆虫嗅觉识别过程中发挥关键作用.本研究表达和纯化了一个新的苜蓿盲蝽气味分子结合蛋白AlinOBP2,采用qRT-PCR方法解析了AlinOBP2基因的表达谱,结果表明AlinOBP2绝大部分在触角中表达,且在雌雄触角中的表达量相当,在头部也有少量的表达.以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合实验研究了5种性信息素类似物和13种棉花挥发物与AlinOBP2蛋白的结合能力.结果显示,5种性信息素类似物均不能和AlinOBP2有效结合,暗示AlinOBP2在苜蓿盲蝽寻找配偶过程中不发挥作用.在13种棉花挥发物中,庚酸乙酯和AlinOBP2的结合能力最强,结合常数为9.22μmol/L.二甲基萘、3-己酮、乙酸叶醇酯、乙酸壬酯、香芹醇5种化合物和AlinOBP2结合能力一般,结合常数分别为15.49,17.31,21.53,18.86和13.47μmol/L.据此推测,AlinOBP2可能为普通气味结合蛋白,能够选择性地结合某些棉花挥发物并参与苜蓿盲蝽识别普通气味过程.     

中红侧沟茧蜂化学感受蛋白MmedCSP1的结合特征

化学感受蛋白是一类存在于昆虫化学感受器中的可溶性蛋白, 被认为与昆虫识别外界化学信息有关。本研究使用pGEX-4T-1表达载体在BL21 (DE3)异源表达系统中表达中红侧沟茧蜂Microplitis mediator化学感受蛋白MmedCSP1, 并通过亲和层析法纯化得到去表达标签的MmedCSP1;使用bis-ANS作为荧光配基, 在荧光分光光度计上研究它与50种气味标样的结合特征, 从而得到此类化学感受蛋白在中红侧沟茧蜂嗅觉识别中识别气味的种类。结果表明: MmedCSP1只能与水杨酸甲酯、戊烷、罗勒烯、β-紫罗兰酮、3, 4-二甲基苯甲醛、2-己酮和叶醇结合。但只有脂类化合物β-紫罗兰酮能在浓度为1 mmol/L下将bis-ANS从MmedCSP1中替换50%, β-紫罗兰酮与MmedCSP1的结合常数为16.89 μmol/L。这些结果提示MmedCSP1参与中红侧沟茧蜂对水杨酸甲酯、戊烷、罗勒烯、β-紫罗兰酮、3, 4-二甲基苯甲醛、2-己酮和叶醇等气味的识别过程, 且在不同气味中的识别过程中对于气味的运输能力有差异。     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

桃蛀螟性信息素结合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表达谱及其与配体化合物的结合特性分析

【目的】为了更好地了解性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在桃蛀螟Conogethes punctiferalis （Guenée）嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合特性。【方法】本研究利用RT-PCR结合RACE方法克隆了桃蛀螟一个性信息素结合蛋白基因;采用Real-time PCR方法分析了该蛋白在桃蛀螟不同发育阶段及雌雄蛾间的表达差异;利用荧光竞争结合实验对Cpun-PBP1蛋白与16种配基化合物的结合特性进行了分析。【结果】克隆了一个桃蛀螟性信息素结合蛋白基因,命名为Cpun-PBP 1（GenBank登录号：KP027486）。Cpun-PBP 1开放阅读框全长510 bp,编码 169个氨基酸,预测分子量为19.12 kDa,等电点为5.09,N-末端包括由起始位置开始的30个氨基酸组成的信号肽。蛋白特征分析显示,该氨基酸序列具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。Cpun-PBP 1在桃蛀螟成虫阶段表达量最高,且几乎全部在触角中表达,卵期微量表达,幼虫期和蛹期均不表达。通过构建Cpun-PBP 1原核表达载体,诱导并获得Cpun-PBP 1重组蛋白。荧光竞争结合实验对2种性信息素组分和14种寄主植物挥发物的结合力发现,Cpun-PBP1不但能有效地与桃蛀螟性信息素组分（顺-10-十六碳烯醛和十六醛）结合,结合常数分别为7.32和9.39 μmol/L;还能与8种寄主植物挥发物有效结合;其中,与莰烯的结合能力最强,结合常数为3.76 μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测Cpun-PBP1在桃蛀螟感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中发挥着双重作用。     

甜菜夜蛾触角结合蛋白Ⅱ的cDNA克隆、 组织分布及配体结合特性分析

触角结合蛋白（antennal binding proteins, ABPs）是气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）的一个亚类, 推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题, 本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术, 克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触角结合蛋白Ⅱ基因（SexigABP2）的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ234486）。序列分析表明, 该基因开放阅读框长444 bp, 编码148个氨基酸, 具有OBPs典型的6个半胱氨酸位点; 其氨基酸序列和烟芽夜蛾Heliothis virescens的HvirABP2的一致性最高, 达72%。实时定量PCR分析显示, 该基因主要在触角中表达, 在喙、 足、 翅等组织中也有少量表达, 且在雌蛾触角及足中的表达量显著高于雄蛾。进一步对该基因进行原核表达和纯化, 利用荧光竞争结合实验测定了SexigABP2对35种气味物质的结合能力, 发现其对甜菜夜蛾性信息素组分(Z)-9-十四碳烯醇和植物挥发物法尼醇的结合能力较强, 结合常数分别为8.24 μmol/L和8.14 μmol/L。结合能力比较表明, SexigABP2对不饱和长碳链化合物较饱和短碳链化合物具有更强的结合能力; 在不饱和长碳链化合物中, 对醇类物质又较乙酸酯类物质具有更强的结合能力。结果提示SexigABP2可能参与了成虫对不饱和长碳链的植物挥发物的感受。     

中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18的原核表达及配体结合特性

【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性。【方法】原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性。【结果】在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白。荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中。荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数K_i值分别为5.21, 6.42, 6.49和6.58μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,K_i值分别为3.86, 5.07, 5.08和6.51μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,K_i值分别为9.09和11.67μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用。【结论】中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别。     

甜菜夜蛾化学感受蛋白SexiCSP3结合特性分析

本研究构建夜蛾科昆虫化学感受蛋白系统进化树,发现化学感受蛋白在种间保守性强,并与气味结合蛋白明显分为两类。运用反转录RT-PCR方法克隆了Sexi CSP3基因,并在大肠杆菌中正确表达,重组Sexi CSP3蛋白纯化后通过荧光竞争结合实验测定其与24种外源气味分子的结合特性。结果表明:Sexi CSP3与苯甲醛、苯乙酮、2-戊基-3-苯丙基-烯醛、1-苯基-1-丁酮、对甲氧基苯甲醛的结合能力较强,解离常数为0.76、1.39、2.23、3.23和5.30μmol/L,推测Sexi CSP3可能参与了甜菜夜蛾对这5种化学物质的识别过程。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP1的克隆、表达及结合特性

利用RT-PCR技术克隆了光肩星天牛Anoplophora glabripennis Motschulsky气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因AglaOBP1(Gen Bank登录号:KX660670),AglaOBP1的开放阅读框长435 bp,编码144个氨基酸,其中N端有21个氨基酸组成的信号肽序列,成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基,AglaOPB1属于Minus-C OBP亚家族基因。AglaOBP1主要在成虫触角中表达,且雌虫触角中的表达量显著高于雄虫触角。重组蛋白AglaOBP1与34种气味配体的竞争结合实验表明,AglaOBP1具有广泛的结合谱,能与五角枫挥发物中的醇类、醛类、萜烯类和酮类物质结合,其中与顺-3-己烯-1-醇、顺-2-己烯-1-醇、1-己醇、反-2-己烯醛、反-2-癸烯醛、β-石竹烯、(+)-桧烯、α-蒎烯、1-(2,3-二甲基苯基)-乙酮的结合能力较强,结合常数分别为5.88、8.33、12.29、12.55、11.90、7.47、9.07、10.29和13.12μM。此外,配体的官能团、碳链长度、空间构型也影响AglaOBP1对气味分子的结合。AglaOBP1基因在成虫触角中高丰度表达,其重组蛋白能够与五角枫挥发物的多种组分结合,表明AglaOBP1在成虫寄主定位选择中起重要作用。     

昆虫触角气味结合蛋白的研究进展

昆虫触角气味结合蛋白是一类亲水性的酸性蛋白,在触角感器淋巴液中浓度很高,主要分为4种,即性外激素结合蛋白、普通气味结合蛋白1、普通气味结合蛋白2和气味结合蛋白类似蛋白。由于它们在昆虫识别外界气味物质中起着重要的作用,近10年来,国外对其进行了广泛、深入的研究。该文从气味结合蛋白的研究方法、生化特性、分子结构和生理功能等方面进行综述。     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

小菜蛾触角结合蛋白PxylOBP31的鉴定与结合特性分析

【目的】触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)为昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)家族的一个亚类,是昆虫识别和响应外界环境中气味信号的载体之一,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确触角结合蛋白在小菜蛾Plutella xylostella(L.)嗅觉识别中的作用,有助于揭示小菜蛾嗅觉识别分子机制。【方法】利用PCR技术克隆小菜蛾的一个触角结合蛋白基因;采用实时荧光定量PCR技术对该基因在小菜蛾不同发育阶段和成虫不同组织中的表达量进行分析;利用荧光竞争结合实验测试该触角结合蛋白与39种配基化合物的结合特性。【结果】成功克隆了一个小菜蛾触角结合蛋白基因,命名为Pxyl OBP31(Gen Bank登录号:KT156676)。序列分析结果显示,其开放阅读框全长411 bp,编码136个氨基酸,N端自起始位置开始21个氨基酸为信号肽,含有气味结合蛋白家族的6个保守半胱氨酸残基,预测分子量为14.74 k D,等电点为4.41。表达谱分析表明,Pxyl OBP31主要在雄蛾中表达,且交配后的雄蛾中表达量明显降低;该基因在小菜蛾触角中有较高表达,在雄蛾触角中的表达量比雌蛾触角中高近2倍。结合特性实验结果显示,Pxyl OBP31与醛、酮、萜品油烯以及邻苯二甲酸二异丁酯等物质的结合能力较强,与3种性信息素及其他烯烃与酯类结合能力弱。【结论】本研究明确了Pxyl OBP31的核苷酸序列以及发育和组织表达谱。根据qRT-PCR和荧光竞争结合实验结果,推测Pxyl OBP31蛋白可能与小菜蛾觅偶、定位寄主植物等行为有关。     

暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析

【目的】暗黑鳃金龟Holotrichia parallela通过气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)识别性信息素和植物挥发物准确而迅速地定位配偶、寄主植物。本研究通过克隆暗黑鳃金龟气味结合蛋白15a(Hpar OBP15a)基因,解析该基因的编码蛋白特征、组织表达模式及与寄主植物气味等化合物的结合特性方面的研究,为阐明暗黑鳃金龟基于嗅觉识别的寄主植物选择机理奠定理论基础。【方法】根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异;荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和58种候选化合物的结合特征。【结果】暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长534 bp,编码147个氨基酸,Gen Bank登录号为AK1834747。Hpar OBP15a在触角中特异表达,且在雌虫触角中表达量显著高于雄虫。在被测的58种化合物中,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,其中与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合能力(解离常数分别为21.0和18.5μmol/L)。【结论】Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。     

二化螟Minus-C气味结合蛋白的分子克隆及功能鉴定

气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫对寄主气味的感受中起重要作用, 但有关Minus-C OBP及其功能的报道很少。本研究通过基因组数据分析并利用RACE技术, 克隆和鉴定了二化螟Chilo suppressalis (Walker)的一个Minus-C OBP基因, 命名为CsupOBP1（GenBank登录号： KC492498）。CsupOBP1基因的开放阅读框长423 bp, 编码141个氨基酸, 其中N端的18个氨基酸为预测的信号肽序列, 成熟蛋白序列中具有4个保守的半胱氨酸位点。实时定量PCR分析显示, 该基因在幼虫头部及成虫雌雄足、 翅和雄性触角等化感组织中高表达, 其中在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角。利用荧光竞争结合实验对CsupOBP1重组蛋白与38种化合物的结合特性的测定表明, 重组CsupOBP1与β 紫罗兰酮的结合能力最强（Ki=9.53 μmol/L）。触角电位测定表明, 二化螟成虫可对β-紫罗兰酮产生显著的触角电生理反应, 但雄虫反应明显强于雌虫, 与结合试验及雄虫触角中CsupOBP1的表达量显著高于雌虫触角的测定结果相一致。鉴于β-紫罗兰酮是水稻等植物中普遍存在的一种芳香气味组分, 推测CsupOBP1可能通过对该气味的结合和运输, 从而在二化螟对寄主植物的嗅觉定向中起作用。