应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

高胆固醇血症小鼠相关基因消减文库的建立

目的 构建高胆固醇血症小鼠cDNA消减文库.方法 以高胆固醇血症小鼠肝组织的eDNA为Teste,以正常小鼠肝组织的cDNA为Driver,应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization).构建正向消减文库,反之构建反向消减文库.结果 成功构建高胆固醇血症cDNA正.反向消减文库,利用葛落PCR技术鉴定文库的阳性克隆.结论 用SSH技术成功构建了高胆固醇血症小鼠差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选.克隆高胆固醇血症小鼠差异表达的基因奠定了基础.     

肺癌诊断基因的初步筛选

目的 筛选肺癌细胞恶性转化不同时期差异表达的基因，以期用于肺癌的诊断。方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)、测序、cDNA芯片(cDNA Miemarray)、northern blot。结果 利用SSH建立了永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，其中，A消减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester，α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆，B消减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester，BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆，C消减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester，BEP2D细胞的eDNA为driver)有586个克隆。对文库中107个克隆单向测序发现：19个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列，其它88个克隆共代表了76个不同的已知基因。然后，将3个文库中全部克隆的cDNA制作成cDNA芯片，用该芯片筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌)中mRNA的表达差异。结果，获得肺癌组织高于肺癌旁组织表达的eDNA26个，肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个，2者高于其他8种癌组织的分别为：肺癌旁组织中63个，肺癌组织中87个。将这208个具较大差异表达的基因重新制作成cDNA芯片，再选用临床上同一鳞癌病人鳞癌和鳞癌癌旁组织各1例与该芯片杂交，发现这些筛选出的基因的确在癌组织和癌旁组织中存在较大差异。结论 这些初步筛选出的差异表达基因有望成为肺癌诊断的侯选基因。     

高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建

目的：构建高脂血症敏感兔肝组织表达基因的抑制差减cDNA文库。方法：分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA，合成双链cDNA，酶切后将敏感组cDNA分成两组，分别与不同的接头连接，再通过再轮差杂交和两次抑制PCR得到两者之间差异表达的cDNA，将PCR产物与T／A载体连接构建差减cDNA文库，挑取克隆进行PCR扩增鉴定，结果：建的差减cDNA文库包含500个克隆，其中463个有插入片段，大小范围在250－700bp之间。结论：用抑制性差减杂交及T／A克隆技术成功构建了高脂血症敏感免疫差异表达基因差减cDNA文库。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

肝癌cDNA文库的构建和IGF—Ⅱ基因的克隆

以5例原发性肝癌组织的pay(A~+)RNA构建一个1×10~6的混合肝癌cDNA文库,并以正常人肝IGF-Ⅱ基因片段为探针筛选此文库,得到多个阳性克隆,从中再以一个较长片段的克隆作为探针对其它组织作Northern杂交分析,发现胎脯、胎肝及其它肝癌组织中的IGF-Ⅱ基因都有过量表达,而正常成年肝组织无明显表达。     

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法：提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果：20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织，其中7例高出4倍以上。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达；CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。     

SSH和cDNA chip筛选辐射致气管上皮细胞恶转不同时期差异表达的基因

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库，BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90、4％、21．6％和19、7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％；R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90、7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。     

肝癌相关基因HCCA2的克隆及其与肝癌的相关性研究

目的　研究和克隆新的肝癌相关基因,探索肝癌发生的分子基础。方法　采用mRNA差异显示技术,分析肝细胞癌和癌旁组织间基因的差异表达情况,获得差异表达基因片断。用此基因片断作为探针,通过筛选胎盘cDNA文库,以获得该基因cDNA全长,并用Northern印迹杂交的方法,分析所获得的新基因在43对肝细胞癌、对应癌旁组织中的差异表达和在正常组织中的分布。结果　克隆了一个新的肝癌相关基因HCCA2的全长cDNA,其在人体正常组织中分布较为广泛,在正常肝组织中不表达。该基因在43对肝癌组织中表达的阳性率是79%(34/43)。它的表达与肝癌包膜的完整性、Ki-67蛋白的表达相关（P<0.01）。结论　肝癌差异表达新基因HCCA2可能与肝癌细胞的浸润和增殖能力有关。     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

应用抑制性差减杂交技术克隆小鼠胸腺细胞发育相关新基因

目的:克隆胸腺细胞发育相关新基因.方法:应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库,结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列.结果:筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了差异表达的cDNA片段,克隆后挑选阳性克隆进行测序,成功克隆8个新基因片段.对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析,mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异.进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列,已被GenBank所接受.结论:抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法;成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列.     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

实时荧光定量PT-PCR检测肝细胞癌中PTCH基因的表达

目的 探讨PTCH基因在肝细胞癌组织中的表达及其与肝癌病理分级的关系.方法 提取手术切除18例不同病理分级的人肝癌、癌旁组织和6例胆管结石手术切除的正常肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA.应用实时荧光定量RT-PCR法观察人肝细胞癌组织与癌旁组织中PTCH基因的相对表达水平,以及观察人正常肝组织中PTCH基因的表达水平.结果 PTCH在所测18例肝细胞癌组织与癌旁组织中均有表达,在6例正常肝组织中不表达,且在病理分级为Ⅰ和Ⅱ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),而在病例分级为Ⅲ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著低于癌旁组织(P=0.024).结论 随着肝癌恶性程度的增加PTCT的mRNA表达量呈递减趋势,提示PTCH可能参与了肝细胞的早期癌变过程.     

膀胱癌差异表达基因BQ135232的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)的差异表达基因.方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)构建膀胱癌和其正常上皮组织差异表达的cDNA消减文库,进一步利用斑点印迹杂交筛选出BTCC差异表达的基因, 对其中明显差异表达的BQ135232应用SMART RACE克隆全长,再应用免疫荧光原位杂交进行染色体定位,并应用Northern blot进行差异表达分析.结果 成功构建了人膀胱癌组织的cDNA消减文库,共含有376个阳性克隆和83个阴性克隆.随机挑出的100个阳性克隆中,76个克隆含有肿瘤差异表达的基因片段,对其进行同源性比对分析,其中有66个克隆为已知基因,其余的10个克隆代表5种未知基因.未知基因中BQ135232共有3个拷贝,染色体定位发现其位于第12号染色体近末端处.Northern杂交分析显示它在膀胱癌组织中高表达,而在正常膀胱组织中无明显表达.结论 本研究表明BQ135232是跟膀胱癌发生发展密切相关的新基因,它的成功克隆为阐明膀胱癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径.     

针刺小鼠丰隆穴对代谢等相关基因表达的影响

目的 针刺小鼠丰隆穴(ST40),以高胆固醇血症疾病为模型,筛选和鉴定针刺治疗相关基因.方法 将小鼠分为正常组、疾病组和针治组,分别将以疾病模型小鼠和针治小鼠肝组织的cDNA为Tester, 以正常小鼠肝组织的cDNA为Driver, 应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization, SSH) 和斑点杂交筛选方法,筛选针刺治疗特异表达基因.结果 成功构建正常组消减疾病组cDNA消减文库和正常组消减针治组cDNA消减文库.在此基础上通过对两个消减文库斑点杂交,筛选出针刺治疗特异表达基因7个,其中未知功能基因1个.结论 SSH技术是筛选新功能基因的有效方法,通过对筛选的6个已知功能基因的分析,推测针刺治疗疾病影响基础代谢、细胞生长和信号传递等方面的基因表达,为研究针刺治疗疾病的分子机理提供理论依据和实验依据.     

KLF6基因在原发性肝癌中的表达

目的 通过研究潜在抑癌基因KLF6在肝细胞癌的表达,探讨KLF6基因作为肝癌抑制基因的可能性.方法 分别用荧光定量PCR、半定量RT-PCR和Western blot方法检测肝细胞癌及癌旁组织中KLF6基因在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果 实时荧光定量PCR显示经过看家基因GAPDH标化的KLF6 cDNA 起始浓度,在配对癌旁组织约为肝癌组织的3倍.26例肝癌组织的KLF6 mRNA表达水平与配对癌旁组织相比,差异具有显著性意义(P<0.01).在肝癌细胞株HepG2及Hep3B,KLF6 mRNA的表达亦显著低于正常对照细胞L02(P<0.01).实验还发现,在肝细胞癌中KLF6蛋白表达变化与mRNA表达变化一致,即KLF6蛋白在癌组织及肝癌细胞的表达明显低于癌旁组织及L02(P<0.01).结论 KLF6表达下调可能是肝细胞癌的遗传学改变之一, KLF6基因可能为新的肝癌相关抑癌基因.     

应用抑制消减杂交技术构建耐多药结核杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库,进一步探索结核杆菌耐多药的分子机制。方法：以耐多药菌株cDNA为实验组（Tester）,敏感株cDNA为驱动组（Driver）应用抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridiza－tion,SSH）技术结合T/A克隆技术构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库。结果：成功构建了耐多药结核菌株差异表达消减cDNA文库,获得113个差异表达cDNA片段。结论：研究表明SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。     

抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库

目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100～600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.