阻断SDF-1／CXCR4轴对多发性骨髓瘤细胞株耐药性的影响

目的探讨阻断SDF-1／CXCR4轴后多发性骨髓瘤细胞株耐药性的影响及机制。方法将耐药细胞株RPM18226／DOX和RPM18226／LP与骨髓基质细胞共培养,实验组同时加入抗CXCR4抗体12G5,未加入抗体者为对照组,测定培养细胞的上清液中的SDF-1α、IL-6、VEGF浓度。进行细胞-基质粘附试验测定实验组和对照组骨髓瘤细胞与基质细胞的粘附性;MTT比色法测定实验组和对照组对阿霉素或马法兰的敏感性。结果实验组中SDF-1α、IL-6、VEGF浓度均略高于对照组,但差异元统计学意义（P〉0．05）。实验组骨髓瘤细胞对基质细胞粘附率低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。药物敏感性检测显示实验组骨髓瘤细胞对阿霉素或马法兰敏感性高于对照组。结论阻断SDF-1／CXCR4轴后可以部分逆转多发性骨髓瘤细胞株对化疗药物的耐药性,其机制与细胞因子无关,可能与下调骨髓瘤细胞与基质细胞的粘附性有关。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

BAFF与Bcl-2mRNA水平对多发性骨髓瘤发生、发展及预后的影响

目的：探讨B细胞活化因子（BAFF）及B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）mRNA表达水平对多发性骨髓瘤临床诊断和预后评估的应用价值。方法：选取本院2011年4月～2013年1月收治的多发性骨髓瘤患者37例,以11例同期健康志愿者为对照组,以密度梯度离心法分离各组骨髓的单个核细胞,采用RT—PCR技术测定BAFF及Bcl-2的mRNA表达水平;同时,采取各组的空腹静脉血,以ELISA试剂盒测定肿瘤负荷标记物β2-微球蛋白（β2-MG）的水平,分析BAFF及Bcl-2的mRNA表达与血清β2-MG含量的相关性。结果：多发性骨髓瘤患者的BAFF及Bcl-2mRNA表达水平显著高于对照组（P〈0．05）;同时,各分期患者之间亦有显著差异,随着分期的递增,BAFF及Bcl-2的mRNA表达水平依次升高（P〈0．05）。直线回归分析结果显示,BAFFmRNA表达水平与血清J32-MG含量呈直线正相关（R^2-7587,P〈0．05）;Bcl-2的mRNA表达水平与血清β2-MG含量亦呈直线正相关（R^2-837,P〈0．05）。结论：BAFF及Bcl-2的mRNA表达水平不仅与多发性骨髓瘤的发病和进程密切相关,且能够较为准确地反映患者机体的肿瘤负荷程度,对多发性骨髓瘤的临床诊断和预后评估均有重要预测价值。     

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的：构建人转化生长因子β2的真核表达载体pcDNA3.1( )/TGF-β2，检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法：用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF-β2全长cDNA，该基因片段两端设计了Nhe I和Xho I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF-β2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1( )上，酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后24h和4周利用RT-PCR和Western-Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序证实，PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF-β2 cDNA序列完全相同。pcDNA3.1( )/TGF-β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF-β2的表达。结论：pcDNA3.1( )/TGF-β2真核表达载体构建成功，在骨髓基质细胞内可获得短暂和长期表达。     

血管内皮因子及IL-6、IL-17在多发性骨髓瘤中的表达与预后的关系

目的：探讨血管内皮因子（VEGF）在多发性骨髓瘤中的表达及其与血管新生、临床预后的关系。方法：运用双抗体夹心ELISA的方法检测了32例多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞VEGF、IL-6、IL-17的表达。结果：与正常对照者相比,多发性骨髓瘤患者高表达VEGF（P0.05）,而Ⅲ期患者VEGF表达均较I期和Ⅱ期显著升高（P     

2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞作用机制的实验研究

目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对骨髓瘤细胞作用的机制.方法 对1例复发性和难治性骨髓瘤细胞进行分离、培养,予0、1、2、4、8和16 μmol/L的2-ME对骨髓瘤细胞处理48h（以0 μmol/L的2-ME作为对照组）.后采用酶联免疫法检测培养上清中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）和IL-6的表达水平,同时采用免疫组化法检测c-myc和bcl-2蛋白阳性表达的骨髓瘤细胞.结果 随着2-ME浓度的增加,培养上清中VEGF和IL-6的表达水平均较对照组明显降低（均P〈0.01）,且骨髓瘤细胞中c-myc和bcl-2蛋白表达阳性率均较对照组明显降低（均P〈0.01）.结论 2-ME对难治性骨髓瘤患者骨髓瘤细胞具有抑制VEGF、IL-6分泌和C-myc、bcl-2蛋白表达水平的作用.     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

脂质体介导TFPI-2质粒DNA转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的探讨角膜基质细胞组织因子途径抑制物2(TFPI-2)的表达情况,为角膜新生血管的基因治疗提供方法.方法体外兔角膜基质细胞原代、传代培养;脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Cite-neo/TFPI-2转染角膜基质细胞,RT-PCR,Western blot技术检测转染前后基质细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白质的表达水平.结果转染前后基质细胞TFPI-2 mRNA的表达水平IATFPI-2/IAβ-actin分别为0.56±0.04、0.78±0.03;蛋白质的表达水平IA值分别为18.4±1.3、24.2±0.5,差异均有显著意义.结论培养角膜基质细胞可基础表达一定量的TFPI-2,转染TFPI-2质粒后使基质细胞TFPI-2 mRNA和蛋白质的表达增高,为开展角膜新生血管的基因治疗提供实验依据.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

蒙花苷对CXCL12诱导人角膜上皮细胞表达VEGF的影响

目的：探讨蒙花苷对基质细胞衍生因子（CXCL12）诱导人角膜上皮细胞（HCEC）表达血管生成因子（VEGF）的抑制作用。方法：培养HCEC,ELISA检测不同滴度CXCL12慢性病毒基因转染HCEC上清液中VEGF含量,并建立细胞模型。ELISA检测不同浓度的蒙花苷干预后细胞上清液VEGF含量,Western Blot检测细胞中的VEGFA蛋白的表达,实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测细胞中的VEGFA mRNA水平的表达。结果：在CXCL12慢性病毒基因滴度为1.775 TU/mL时,HCEC分泌的VEGF的含量明显高于正常细胞组及阴性对照组（P<0.05）,具有显著性差异。选用1.775 TU/mL滴度的CXCL12慢性病毒基因对HCEC进行造模。与模型组及阴性对照组比较,不同浓度的蒙花苷均能减少HCEC分泌VEGF,减少VEGFA蛋白含量和VEGFA mRNA表达量（P<0.05）。不同浓度的蒙花苷作用比较差异有统计学意义（P<0.05）,随蒙花苷浓度增加,呈先增强后减弱的趋势,且当浓度为66.7μmol/L时对VEGFA蛋白及mRNA表达抑制力最为显著。结论...     

VEGF在子宫内膜异位症在位内膜的表达及意义

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）在子宫内膜异位症（EMs）在位内膜与对照组子宫内膜表达的差异。材料与方法取EMs在位内膜16例、正常子宫内膜（对照组）16例，以免疫组化染色法，研究VEGF在不同月经周期的表达。结果（1）VEGF在对照组子宫内膜基质及腺体细胞均有较高的阳性表达，增殖期高于分泌期（P〈0．05）。（2）在EMs在位内膜中，VEGF于增殖期在基质及腺体中表达降低，而于分泌期在基质细胞中表达明显升高（P〈0．05）。结论VEGF在EMs在位内膜分泌期基质中的高表达，提示EMs在位内膜基质细胞在分泌期侵袭、种植能力增强，验证了EMs“在位内膜决定论”的新概念。     

Bcl-2结合抗凋亡基因1的表达与多发性骨髓瘤的相关性

目的:观察蛋白和核酸水平Bcl-2结合抗凋亡基因1(Bcl-2-Associated Athanogene1,BAG-1)在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的表达,探讨BAG-1在多发性骨髓瘤发病机制中的作用及其临床意义,为多发性骨髓瘤的治疗寻找相关的理论依据。方法:选取皖南医学院附属弋矶山医院2006年10月~2008年10月初诊MM患者骨髓活检标本28例用于BAG-1免疫组化检测;同时抽取上述患者骨髓液提取单个核细胞,用于BAG-1mRNA RT-PCR检测。结果:初诊多发性骨髓瘤患者的BAG-1蛋白表达水平率为64.29%,和对照组相比增高明显(P=0.008)。同样在核酸水平,BAG-1mRNA在初诊骨髓瘤患者表达率为71.4%,高于对照组(P=0.007)。BAG-1高表达的MM肿瘤负荷高、与多项临床指标有关。结论:BAG-1蛋白及BAG-1基因在多发性骨髓瘤患者中高表达,与对照组相比有显著性差异,与临床多项指标有关,经分析可能参与多发性骨髓瘤的发生,BAG-1蛋白及其基因高表达可能提示患者不良预后。     

骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的检测骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨潜能的影响,探讨骨髓瘤细胞在骨髓瘤骨病发病机制中的作用。方法分离培养骨髓间充质干细胞,鉴定其生物学特性。采用midiMACs阳性免疫磁珠分选系统分离多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓CD138＋细胞,与骨髓间充质干细胞行Transwell成骨共培养,两周后进行定时定量PCR检测间充质干细胞成骨指标骨特异性碱性磷酸酶（ALP）和Cbfa1的mRNA表达量,Von Kossa染色鉴定其钙质沉积程度改变。结果骨髓CD138＋细胞可以抑制骨髓间充质干细胞ALP和Cbfa1的mRNA表达量,间充质干细胞钙质沉积也相应减少。结论骨髓瘤细胞可抑制骨髓间充质干细胞的成骨潜能,这种抑制作用可能参与了骨髓瘤骨病的发生。     

多发性骨髓瘤细胞通过PI3K/AKT信号通路促进M2巨噬细胞极化的机制研究

背景 多发性骨髓瘤发病率长期居高不下，但目前关于磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）信号通路和M2巨噬细胞极化促进多发性骨髓瘤发生进展的研究较少。目的 探讨M2巨噬细胞在多发性骨髓瘤患者中的表达及PI3K/AKT信号通路促进M2巨噬细胞极化的机制研究。方法 选取2021年10月—2022年4月于桂林医学院附属医院血液内科确诊的多发性骨髓瘤患者48例为试验组，选取同期健康志愿者（血液内科骨髓移植健康供者）30名为对照组。取2组研究对象外周血并分离单个核细胞，流式细胞术检测M2巨噬细胞比例。采用细胞传代培养RPMI8226细胞，通过佛波酯分化培养单核巨噬细胞THP-1为巨噬细胞。根据实验需要将瘤细胞培养并采用siRNA转染沉默磷酸酶基因（PTEN）分成3组：空白组、siRNA-PTEN实验组、siRNA对照组；收集以上3组细胞培养基上清液加入巨噬细胞共培养体系后分为4组：M0巨噬细胞组、瘤细胞上清液组、siRNA-PTEN上清液组、siRNA上清液组。采用Western blot实验检测多发性骨髓瘤细胞培养的空白组、siRNA-PTEN实验组、siRNA对照组的A...     

加味桃红四物汤对骨髓基质干细胞体外诱导的实验研究

目的研究加味桃红四物汤对骨髓基质干细胞早期促缺氧诱导因子（HIF-1）与血管内皮生长因子（VEGF）分泌的影响。方法骨髓基质干细胞取材,设置中药组及生理盐水组,观察HIF-1、VEGF表达。结果中药组对骨髓干细胞培养第2d HIF-1α表达量开始出现,第5、7天后中药组HIF-1α mRNA的表达量显著低于生理盐水组。而第3、5、7、14天VEGF表达中药组表达较生理盐水组强,在第5、7天VEGF表达达到峰值。结论加味桃红四物汤可以诱导骨髓基质干细胞向血管祖细胞分化,并促相关生长因子表达。     

不同来源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察人脐血基质细胞及骨髓瘤患者骨髓基质细胞对骨髓瘤KM3细胞生物学特性的作用.方法 体外分离培养骨髓瘤骨髓基质细胞和人脐血源基质细胞,与骨髓瘤KM3细胞共培养.采用扫描电镜观察共培养后基质细胞和KM3细胞的位相关系;应用CCK-8、P I染色流式细胞仪和Annexin V/P I双标法检测不同培养条件下KM3细胞的增殖、细胞周期和凋亡率.结果 人脐血基质细胞比骨髓瘤患者骨髓基质细胞有更强的抑制KM细胞增殖的作用;共培养后骨髓瘤患者骨髓基质细胞使KM3细胞阻滞于G0/G1期[(59.70±1.28)%],人脐血基质细胞使S期的KM3细胞比例增高[(46.07±2.46)%];KM3/MM-BMSCs组KM3细胞凋亡率为(3.26±0.12)%明显低于KM3/hUCBDSCs组KM3细胞凋亡率(4.76±0.12)%(P<0.01);KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bax mRNA的表达较KM3/hUCBDSCs组明显下降(P<0.01);KM3/hUCBDSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达较KM3细胞悬浮培养组下降(P<0.05),KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达则明显升高,为悬浮培养组的1.982倍(P<0.01).结论 骨髓瘤基质细胞微环境抑制骨髓瘤细胞凋亡和死亡;而人脐血源基质细胞有更强的抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,并促进其凋亡.     

多发性骨髓瘤细胞中C-IAP2表达及其相关研究

目的探讨细胞凋亡抑制蛋白-2（cellular inhibitor of apoptosis protein-2,C—IAP2）在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）发病机制中的作用,为MM治疗提供新的思路和理论依据。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测c—IAP2 mRNA在MM患者中的表达,分析c—IAP2 mRNA与半胱氨酸-天门东氨酸酶-3（cysteine—aspartic proteases-3,caspase-3）蛋白、核因子-κBp65（NF—κBp65）mRNA的相互关系。结果初诊MM患者的c—IAP2 mRNA表达水平高于对照组（P〈0．05）,c—IAP2 mRNA与NF—κBp65 mRNA表达水平呈正相关（r=0．681）,与caspase-3蛋白表达水平呈负相关（r=-0．547）。结论c—IAP2 mRNA在多发性骨髓瘤中高表达,与对照组相比差异有统计学意义,经分析表明c—IAP2基因在多发性骨髓瘤发病中可能具有促进作用.     

人线粒体超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及其在HUVEC中的表达

目的：构建人线粒体超氧化物歧化酶2（SOD2）的真核细胞表达载体，探讨其在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的表达效果。方法：以HUVEC mRNA为原始模板,应用RT-PCR技术,扩增编码线粒体SOD2全长的cDNA片段。利用分子生物学技术，将扩增的cDNA片段与真核细胞表达载体pcDNA3.0的多酶切位点相连接，构成重组质粒并转染到HUVEC，将细胞分为HUVEC母细胞组、转染pcDNA3.0空载组和转染pcDNA3.0-SOD2组。应用RT-PCR方法检测SOD2在HUVEC中的表达情况。结果：将表达SOD2全长cDNA片段定向克隆至质粒pcDNA3.0，测序结果表明成功构建人线粒体SOD2的真核细胞表达载体pcDNA3.0-SOD2。该载体稳定转染HUVEC后，在细胞内获得了稳定表达。与母细胞组和空载组比较，转染pcDNA3.0-SOD2组SOD2 mRNA表达水平明显增加。结论：成功构建SOD2的真核细胞表达载体pcDNA3.0-SOD2，并在人HUVEC中成功表达。本研究为SOD2对细胞保护作用研究提供了实验模型。