抗纤维化短肽对血清诱导的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成与Ⅰ、Ⅲ型胶原表达抑制作用的实验研究

①目的 探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对不同浓度血清(FBS)诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的调节作用.②方法 选用新生大鼠心脏成纤维细胞;采用3H-TdR掺入法检测心脏成纤维细胞的增殖;采用3H-脯氨酸掺入法检测心脏成纤维细胞胶原的合成,采用westernblot法检测心脏成纤维细胞Ⅰ型与Ⅲ型胶原的表达.③结果 在0.4%、2%和10%几种血清浓度的条件下,随着血清农度的增加,反映心脏成纤维细胞增殖3H-TdR掺入量和胶原合成的3H-脯氨酸掺入量增加.表明一定浓度的血清能诱导心脏成纤维细胞增殖和胶原合成.与0.4%血清的基础培养条件相比较,10%高浓度血清能刺激心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达.在10-10～10-8mol/L浓度范围内.AcSDKP对10%诱导的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成有抑制作用.并且在10-9mol/L时,AcSDKP对心脏成纤维细胞增殖、胶原合成抑制作用最强.同时10-9mol/L的AcSDKP对心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达也有明显的抑制作用.④结论 AcSDKP对血清介导的心脏成纤维细胞增殖、胶原合成以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达有明显抑制作用.     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对血清诱导的心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性表达的调节作用

①目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对不同浓度血清（FBS）诱导的大鼠心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9酶活性表达的调节作用。②方法选用新生大鼠心脏成纤维细胞；采用明胶酶谱法检测心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9酶活性的表达。③结果在0．4％、2％和10％几种血清浓度的条件下，随着血清浓度的增加，MMP-2、MMP-9酶活性表达增强。AcS-DKP能够进一步增加由10％血清诱导的心脏成纤雏细胞MMP-2、MMP-9酶活性的表达。④结论AcSDKP上调了由血清介导的心成纤维细胞MMP-2，MMP-9酶活性表达，这可能与AcSDKP抗心脏纤维化的作用相关。     

AcSDKP抗肾间质纤维化作用及对TGF-β1、Smad7表达的影响

目的 观察N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对大鼠单侧输尿管结扎(UUO)梗阻致肾间质纤维化(RIF)模型中肾组织病理变化、转化生长因子β1(TGF-β1)和Smad7表达的动态变化的影响.评价AcSDKP对RIF的作用,初步探讨其作用的可能机制.方法 成年SD大鼠54只,随机分为3组,即假手术对照组(C组)、UUO模型组(Ivl组)和AcSDKP治疗组(T组),每组各18只.每组于术后第3、7和14天分批处死又分为N3、N7和N14 3组,每组各6只.T组术后立即于皮下置入含AcSDKP的微量释放泵,持续皮下给药按800μg/(kg·d)执行.C组、M组则分别予等量生理盐水持续皮下给药.术后第3、7和14天处死各组大鼠,分别取出左肾的1/2制作切片,行HE和Masson染色,观察肾脏病理学动态改变;免疫组化法检测肾间质组织内TGF-β1和Smad7蛋白的表达.结果 HE染色及Masson染色显示:M组术后随时间延长肾小管间质病变加重,程度同期最重,高于同期T组及C组;T组病变程度介于同期M组及C组之间;C组基本正常,结果有统计学意义(P<0.05).M组TGF-β1蛋白表达随时间延长逐渐上调,程度同期最高,高于同期T组及C组;T组蛋白表达程度介于M组及C组之间;C组表达最低,结果有统计学意义(P<0.05);M组肾间质Smad7的表达随时间延长逐渐下调,程度同期最低,低于同期T组及C组;同期T组肾间质Smad7表达明显上调,低于同期C组,但高于M组,结果有统计学意义(P<0.05);M组与T组各组内肾小管间质损害指数与TGF-β1蛋白表达呈正相关,Smad7蛋白表达与上述各指标呈负相关,结果有统计学意义(P<0.05).结论 AcSDKP对大鼠RIF有抑制作用,其机制可能通过增加大鼠UUO模型中Smad7蛋白的表达抑制TGF-β1信号转导,发挥抗大鼠RIF的作用.     

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对肌成纤维细胞分化的作用

目的矽肺是我国最严重的职业病之一。文中研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP)对血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅱ诱导的细胞外信号调节激酶信号(extracelluler signal-regulated kinase,ERK1/2)信号和Jun氨基末端激酶信号(Jun N-terminal kinase,JNK)的调控,抑制人胚肺MRC-5成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。观察AngⅡ是否经由ERK1/2和JNK信号诱导人胚肺MRC-5成纤维细胞向肌成纤维细胞分化以及Ac-SDKP对此过程的调节作用。方法实验分为5组:对照组(无血清培养基培养)、AngⅡ诱导组(采用100 nmol/L AngⅡ诱导MRC-5细胞)、SP600125干预组(予以JNK信号阻断剂SP600125预处理)、PD98059干预组(ERK1/2信号阻断剂PD98059预处理)和Ac-SDKP干预组(Ac-SDKP预处理)。MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及其上游转录因子血清反应因子(serum response factor,SRF)、p-ERK1/2和p-JNK的定位及表达;Western blot法检测Ⅰ型胶原、α-SMA、SRF和p-ERK1/2、p-JNK的表达水平。结果 AngⅡ诱导组A值(0.56±0.08)为对照组(0.27±0.05)的2.07倍;SP600125干预组、PD98059干预组和Ac-SDKP干预组A值分别为(0.39±0.02)、(0.40±0.03)、(0.36±0.05)与AngⅡ诱导组(0.56±0.08)比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);AngⅡ诱导组的Ⅰ型胶原、α-SMA、SRF蛋白水平明显上调,分别是对照组的4.50、3.50和3.00倍;AngⅡ诱导组能够上调p-JNK和p-ERK1/2的表达,分别是对照组的6.71和7.90倍;而Ac-SDKP干预组能够抑制p-JNK和p-ERK1/2的表达,分别是AngⅡ诱导组的29.79%和46.84%。结论Ac-SDKP能够通过对AngⅡ介导的ERK1/2信号、JNK信号的调节,抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。     

AcSDKP对硅肺纤维化大鼠胶原含量及NF-κBp65表达的影响

目的研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对硅肺纤维化大鼠肺内胶原合成及核转录因子κB(NF-κB)p65的影响。方法将大鼠分为3组:对照组(每只大鼠支气管内灌注生理盐水1mL,8周后处死)、硅肺模型组(每只大鼠支气管内灌注SiO2混悬液1mL,8周后处死)、AcSDKP治疗组(每只大鼠支气管内灌注SiO2混悬液1mL,并持续给予AcSDKP 800μg·kg-1·d-1,8周后处死)。从HE染色、VG染色和羟脯氨酸胶原测定法检测各组大鼠肺纤维化程度及胶原含量,用免疫组化法和免疫印迹法检测NF-κB p65蛋白的表达。结果与对照组比较,硅肺模型组硅结节的数量、胶原含量和NF-κB p65的表达增高。与硅肺模型组相比,AcSDKP治疗组矽结节的数量、胶原含量和NF-κB p65的表达降低。结论 AcSDKP可能会通过增加B抑制蛋白(I-κB)的稳定性来抑制NF-κB p65的活性及表达,进而影响着肺泡炎与硅肺纤维化的进展。     

川芎嗪对心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的观察川芎嗪（TMP）对体外培养心脏成纤维细胞（CF）的增殖与胶原合成的影响。方法用消化法培养新生SD大鼠的CF，用四氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖，羟脯氨酸碱水解法测定胶原合成．观察不同浓度TMP对CF增殖和胶原合成的影响。结果随着TMP浓度的升高，MTT比色法A490值呈下降趋势；CF分泌的胶原随着TMP作用浓度和时间的增加呈递降趋势。结论TMP具有抑制SD新生大鼠CF增殖和胶原合成的作用。     

溶血磷脂酸对心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的：观察溶血磷脂酸（LPA）对体外培养心脏成纤维细胞（CF）的细胞增殖和胶原合成的影响。方法：用消化法培养新生SD大鼠的CF，实验分为四组。对照组（加含5％小牛血清的DMEM培养液），实验组根据不同浓度的LPA又分为10^-6μmol／L组、10^-7μmol／L组和10^-8μmol／L组。用单四唑（MTT）比色法测定细胞增殖，羟脯氨酸碱水解法测定胶原合成，分别观察不同浓度LPA对CF增殖和胶原合成的影响。结果：①随着LPA浓度的升高，MTT比色法吸光度（A490）值呈上升趋势。在药物作用48h后，仅有10^-6μmol／L组A。值较对照组有显著升高（P〈0．05）；作用至72h后，10^-8μmol／L组、10^-7μmol／L组、10^-6μmol／L组A490值均较对照组显著升高（P〈0．05）；作用至96h后，各实验组A。值较对照组均有显著升高（P〈0．05和P〈0．01）。②随着LPA浓度和作用时间的增加，CF分泌的胶原呈递增趋势。LPA作用48h仅10^-6μmol／L组胶原浓度较对照组显著升高（P〈0．01）；作用至72h后，10^-7μmol／L组、10^-8μmol／L组胶原含量较对照组有显著升高（P〈0．05和P〈0．01）；作用至96h，各实验组胶原含量均较对照组有显著升高，10^-6μmol／L组与10^-7μmol／L组、10^-8μmol／L组之间差异亦有显著性意义（P〈0．05）。结论：LPA具有促进SD新生大鼠CF增殖和胶原合成的作用。     

Ac-SDKP对实验性矽肺纤维化模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞衰老信号激活的调节作用

目的 观察N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)对实验性矽肺纤维化进程中肺泡II型上皮细胞细胞衰老的作用及其机制.方法 SPF级Wistar大鼠分组为对照组、矽肺模型组和Ac-SDKP治疗组.肺泡II型上皮MLE-12细胞分组为空白对照组、SiO2组、Ac-SDKP组和SiO2+Ac-SDKP组...     

川芎嗪对溶血磷脂酸诱导的心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的:观察溶血磷脂酸(LPA)对体外培养的心脏成纤维细胞(CF)增殖的影响,进一步研究中药川芎嗪单体对其的干预作用。方法:用消化法培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞,用单四唑(MTT)比色法测定细胞增殖,羟脯氨酸碱水解法测定胶原合成,分别观察不同浓度LPA对CF增殖和胶原合成的影响及川芎嗪的干预作用。结果:随着LPA浓度的升高,MTT比色法A490值呈上升趋势。CF分泌的胶原随着LPA浓度和作用时间的增加呈递增趋势。20μg/m l的川芎嗪作用48 h即能明显抑制LPA(10-6μmol/L)诱导的细胞增殖作用(P<0.05)。结论:LPA具有促进SD新生大鼠CF增殖和胶原合成作用,而川芎嗪能对其产生明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。     

PDGF/ROCK通路在AcSDKP抑制大鼠矽肺纤维化形成中的作用

目的:探讨血小板源性生长因子/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(PDGF/ROCK)通路在肺纤维化发病机制中的作用以及N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)能否通过对PDGF/ROCK的调节而发挥抗矽肺纤维化作用。方法:采用非暴露式气管二氧化硅混悬液灌注法制备大鼠矽肺模型。60只SPF级健康成年Wistar 大鼠随机分为模型对照4周组、模型对照 8 周组、矽肺模型 4 周组、矽肺模型 8 周组、AcSDKP 治疗组和AcSDKP预防治疗组,每组10 只。免疫组织化学染色法检测各组大鼠肺组织中phospho-PDGFR-β的表达与分布,Western blotting法检测各组大鼠肺组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PDGFR-β、phospho-PDGR-β、ROCK、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的表达。 结果:与相应模型对照组比较,矽肺模型组大鼠肺组织中α-SMA、PDGFR-β、phospho-PDGFR-β、ROCK以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);形态学检测可见较多的phospho-PDGFR-β阳性表达细胞分布在矽结节与间质纤维化区域。与矽肺模型4周组和模型8周组比较,AcSDKP 治疗组和预防治疗组大鼠肺组织中α-SMA、PDGF-β、phospho-PDGFR-β、ROCK、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);免疫组织化学染色,phospho-PDGFR-β蛋白表达明显减少。 结论:PDGF介导的ROCK信号转导通路可能通过促进大鼠肌成纤维细胞转化而促进矽肺大鼠肺组织中的胶原合成,进而促进矽肺纤维化的形成。AcSDKP 可能通过PDGF/ROCK通路抑制矽肺大鼠肺内肌成纤维细胞的分化,减少其胶原的合成与分泌,进而发挥抗矽肺纤维化的作用。     

降钙素基因相关肽对异丙肾上腺素诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原表达的影响(英文)

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对异丙肾上腺素诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原表达的抑制作用及其潜在的机制。方法:异丙肾上腺素(10–5mol/L)孵育48 h以诱导体外培养的心肌成纤维细胞增殖和胶原表达,不同浓度的CGRP(10–8或10–7mol/L)在异丙肾上腺素孵育前1 h给药。药物处理结束后,用MTT法检测细胞活性,RT-PCR检测I和III型胶原和结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达,DCFH-DA荧光法检测细胞内ROS的水平。结果:异丙肾上腺素能明显促进成纤维细胞的增殖,上调I和III型胶原以及CTGFmRNA表达,同时伴随着ROS产生的增加。预先给予CGRP可显著抑制异丙肾上腺素的上述效应,但CGRP的有益效应可被选择性CGRP受体拮抗剂CGRP8–37所取消。结论:CGRP可抑制异丙肾上腺素诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原表达,其机制与抑制ROS的产生进而下调CTGF的表达有关。     

胱抑素C对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

目的 探讨胱抑素C（CysC）高表达对大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖能力的影响。方法 取出生1～3d的Sperague-Dawley（SD）清洁级大鼠10只,体质量10～15g,差速贴壁法培养乳鼠心肌成纤维细胞;采用Gateway技术构建重组CysC腺病毒高效表达载体(Ad-CysC)并体外转染大鼠CFs;将对数生长期的大鼠CFs随机分成正常细胞组（PBS组）,携有绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒组（Ad-GFP组）及CysC腺病毒高表达组(Ad-CysC组)。采用蛋白免疫印迹技术（WB）检测CysC蛋白在CFs中的表达情况,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法检测CysC高表达对CFs增殖能力的影响。结果 经DNA测序及WB结果分析,CysC腺病毒高效表达载体构建成功,转染CFs 24h后（MOI=200）,Ad CysC的转染效率高达90%以上;用重组CysC腺病毒转染CFs后, CysC蛋白在24h即有明显的表达上调（P<0.05）;与PBS组及Ad-GFP组相比,转染Ad-CysC的CFs在72h的 BrdU摄取率显著提高（P<0.05）。结论 大鼠CysC腺病毒高效表达能够促进CFs增殖,可能加速心肌纤维化进程。     

以转录因子AP-1为靶点的decoy ODNs对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的抑制作用

目的 探讨AP-1 decoy ODNs对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖及细胞胶原合成的抑制作用,为高血压心肌纤维化的防治提供理论依据.方法 通过2.5％胰酶分离培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞,采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞数目,羟脯氨酸比色法测定培养细胞上清胶原合成,流式细胞分析技术(FCM)检测细胞周期,分别观察不同浓度的AP-1 decoyODNs对AngⅡ诱导的CFs增殖,胶原的合成及细胞周期的影响.结果 CFsMTT比色法显示10-7mmol/LAngⅡOD490值明显高于空白对照组(0.451±0.014和0.342±0.096,n=9,P<0.05);100 mnol/L和200 mmol/L组的OD490值分别为0.329±0.04和0.214±0.25,均较AngⅡOD490值显著降低(P<0.05);AngⅡ作用24 h后能够显著增加CFs胶原合成,decoy ODNs可以抑制这种作用,其中100 nmol/L和200 nmol/L均有显著性抑制作用.FCM细胞周期分析表明,AngⅡ作用24 h后能够明显增加S期细胞百分率(21.93±0.71％和10.93±0.2％,n=6,P<0.01),随着decoy ODNs浓度增加,S期细胞百分率明显降低,其中100nmol/L和200nmol/L作用具有显著性意义(P<0.01).但突变的decoyODNs对CFs的增殖及胶原合成均没有明显的影响.结论 AP-1 decoy ODNs可以抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原的合成,其作用机制可能与影响CFs细胞周期有关.     

钙调神经磷酸酶调控血管升压素诱导大鼠心脏成纤维细胞胶原合成的作用

目的：探讨钙调神经磷酸酶（CaN）信号通路对血管升压素（AVP）诱导新生大鼠心脏成纤维细胞（CF）胶原合成的调控作用。方法：采用胰酶消化法培养新生SD大鼠CF，应用羟基脯氨酸比色法测定细胞培养上清中羟基脯氨酸含量，CaN活性通过分光光度计测定。结果：①CF培养上清中羟基脯氨酸含量随着AVP浓度的升高而增加，其中10^-7mol／LAVP和10^-6mol／LAVP组羟基脯氨酸含量与空白对照组比较有显著性差异（均P〈0．01）；在0．5μg／mlCaN的特异性抑制剂环孢素共同干预下，羟基脯氨酸含量明显减少，并有统计学意义（P〈0．01）。②随着AVP浓度的升高，CF内CaN活性亦随之增高，与空白对照组比较，10^-7和10^-6mol／LAVP组细胞内CaN活性显著增高（P〈0．01）。③在10^-7mol／LAVP作用下，随着细胞内CaN活性的升高，CF培养上清中羟基脯氨酸含量随之增加，两者之间呈显著正相关（r=0．91，P〈0．05）：④在10^-7mol／LVI受体拮抗剂[d（CH2）5-Tyr2（Me）]AVP和10^-7mol／LAVP共同作用下，CF中CaN活性和培养上清中羟基脯氨酸含量与单独10^-7mol／LAVP作用组比较均显著降低，并有统计学意义（均P〈0．01）：结论：CaN信号通路在AVP诱导CF胶原合成过程中起到了重要的调控作用，该通路的激活可能是通过V1受体介导的.     

罗格列酮对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节

目的观察罗格列酮（Ros）对高糖刺激下新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达的调节。方法 30 mmol/L高糖（HG）孵育新生大鼠心脏成纤维细胞,其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12 h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响;另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36 h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响;另设HG模型组（仅HG干预）及空白对照组[0.1%胎牛血清DMEM培养基＋常规血糖浓度（NG）干预]各1组。应用Real-time PCR法测定心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达;Western blot检测Ⅰ型前胶原蛋白质的表达。结果 HG模型组Ⅰ型前胶原mRNA[（109±11）%]和蛋白（1.57±0.02）的表达与空白对照组[（40±3）%、（0.82±0.04）]比较显著升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。浓度依赖性实验结果显示,HG＋10μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[（91±9）%]和蛋白（1.35±0.03）的表达低于HG模型组;HG＋30μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[（62±5）%]和蛋白（1.08±0.04）的表达低于HG＋10μmol/L Ros组;HG＋50μmol/L Ros组Ⅰ型前胶原mRNA[（51±4）%]和蛋白（0.93±0.02）的表达低于HG＋30μmol/L Ros组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。时间依赖结果显示,HG＋30μmol/L Ros 18 h组Ⅰ型前胶原mRNA[（91±10）%]和蛋白（1.31±0.07）的表达低于HG模型组[（109±11）%、（1.57±0.02）];HG＋30μmol/L Ros 24 h组Ⅰ型前胶原mRNA[（67±6）%]和蛋白（1.01±0.04）的表达低于HG＋30μmol/L Ros 18 h组;HG＋30μmol/L Ros 36 h组Ⅰ型前胶原mRNA[（42±4）%]和蛋白（0.87±0.01）的表达低于HG＋30μmol/L Ros 24 h组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 Ros可呈浓度和时间依赖性地下调高糖刺激下新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达,可能在抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。     

血小板源性生长因子诱导大鼠心脏成纤维细胞胶原合成的信号转导途径研究

①目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径在血小板源性生长因子(PDGF)刺激大鼠心脏成纤维细胞胶原合成中的作用。②方法分离培养新生大鼠心脏成纤维细胞。免疫细胞化学法、Western blot法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化。③结果与对照组相比,在PDGF刺激下,大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加,PD98059 25μmol/L预孵育1小时能够抑制PDGF的刺激作用。④结论PDGF能够通过ERK1/2途径调节大鼠心脏成纤维细胞的胶原合成。