人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

Flag-p107真核表达载体的构建及其在ECA109细胞表达及鉴定

目的 构建N端含flag标签的p107的真核表达载体,及其在EC109细胞表达的鉴定.方法 设计引物在p107蛋白N端增加flag标签,通过PCR扩增获得3×flag-p107 cDNA片段,将此片段插入真核表达质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin中;再与质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin连接,将所得的融合基因进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用电转染将其转染至ECA109细胞中;利用Western-Blotting检测融合蛋白CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin的表达情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在ECA109细胞中表达.结论 成功构建真核表达载体CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin并建立了其在ECA109细胞的表达.     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:构建pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒,为mGM-CSF-mMIP-3α基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法:利用本实验室保存的pCDNA3.1mGM-CSF和pCDNA3.1mMIP-3α质粒,采用分子生物学技术构建了pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒.用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染B16细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果:重组质粒中含有mGM-CSF-mMIP-3α基因,转染B16细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用ELISA和Westernblot检测证明能与特异性mGM-CSF和mMIP-3α抗体结合.结论:成功构建含mGM-CSF-mMIP-3α真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

MDM2基因真核表达质粒构建及对人乳腺癌MCF-7细胞运动与侵袭能力的影响

目的 构建MDM2的pcDNA3.1真核表达质粒(pcDNA3.1-MDM2),并将其转染至人乳腺癌MCF-7中,考察MDM2蛋白过表达对乳腺癌转移的影响。方法 采用PCR方法体外克隆MDM2基因全序列,并将其用同源重组技术连接到真核pcDNA3.1质粒载体上,构建真核表达质粒,并进行测序鉴定,利用脂质体法转染至MCF-7细胞中。通过G418抗生素筛选出单克隆高表达细胞系,使用免疫印迹法考察MDM2蛋白表达。同时,通过划痕试验及transwell法来检测细胞的运动与侵袭能力。结果 测序结果表明pcDNA3.1-MDM2基因序列准确无误,免疫印迹法表明稳定转染细胞系构建成功,划痕试验及transwell试验表明MDM2高表达细胞系的运动与侵袭能力增加。结论 成功构建了pcDNA3.1-MDM2真核表达质粒,转染MCF-7细胞后,可稳定表达,并促进了MCF-7细胞的运动及侵袭,为研究MDM2蛋白表达对人乳腺癌转移的分子机制及作为诊疗的生物标志物奠定了基础。     

野生型犬尿氨酸酶表达载体的构建及酶活性检测

目的构建野生型犬尿氨酸酶(KYNU)的真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达及其酶活性。方法抽提人肝脏细胞的总RNA,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得KYNU基因全长cDNA,将野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,用蛋白质印迹法技术检测野生型KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测HEK293细胞表达的野生型KYNU酶蛋白的活性。结果通过测序及酶切鉴定野生型pcDNAKYNU重组表达质粒扩增后的PCR产物电泳结果显示构建成功,蛋白质印迹法结果显示转染有重组野生型cDNA-KYNU质粒的HEK293细胞能表达KYNU蛋白,HPLC结果显示野生型KYNU酶存在活性。结论成功构建野生型pcDNA-KYNU的真核表达载体,野生型重组质粒在HEK293细胞中能够表达KYNU并具有一定的酶活性。     

mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:构建pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒,为mGM-CSF-mMIP-3α基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法:利用本实验室保存的pCDNA3.1mGM-CSF和pCDNA3.1mMIP-3α质粒,采用分子生物学技术构建了pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒.用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染B16细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果:重组质粒中含有mGM-CSF-mMIP-3α基因,转染B16细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用ELISA和Westernblot检测证明能与特异性mGM-CSF和mMIP-3α抗体结合.结论:成功构建含mGM-CSF-mMIP-3α真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞模型的建立

目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达。结果经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因。结论成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础。     

趋化因子受体CCR6的克隆及其在HEK293细胞中的表达

目的：构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体，并了解其在HEK293细胞中的表达。方法：提取人淋巴结总RNA，通过逆转录PCR扩增出CCR6基因片段，并构建真核表达载体pcDNA3，1（＋）-CCR6；重组载体通过脂质体转染HEK293细胞，免疫荧光法鉴定CCR6的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有CCR6编码序列．转染实验表明重组质粒能在HEK293细胞中表达出具有活性的CCR6片段。结论：CCR6真核表达载体构建及表达成功，为下一步CCR6拈抗剂的筛选奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ的构建和鉴定

目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基macacam ulattac horionicg onadotrophin β subunit,rmCGβ）基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ。结论成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

小鼠IL-18真核表达质粒的构建及其生物学活性的鉴定

目的构建小鼠白细胞介素18(interleukin18,IL-18)的真核表达质粒,并检测其表达的IL-18的生物学活性。方法采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应,构建pEGFP-mIL-18真核表达载体,重组载体经过限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,转染HEK293细胞系,荧光显微镜观察GFP-mIL-18融合蛋白的表达,收集转染后72h的上清液,MTT法检测上清液中IL-18表达产物的生物学活性。结果酶切分析、PCR鉴定、DNA测序表明成功地构建了pEGFP-mIL-18真核表达载体,MTT法证明表达产物有刺激小鼠脾细胞增殖的功能。结论所获pEGFP-mIL-18真核表达载体能在体外表达具有生物学活性的IL-18,为进一步研究IL-18的功能和运用奠定了基础。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10（IP-10）基因的真核表达质粒,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段,通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP—cl和连接反应,构建IP-10的真核表达质粒pEGFP—cl—IP-10,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测pEGFP—cl—IP-10在NIH 3T3细胞中的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因片段被成功克隆人真核表达质粒载体pEGFP—cl,免疫荧光技术检测证实,该基因能在NIH 3T3细胞中表达。结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达,为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础。     

HPVl8 E7联合SLC基因疫苗的构建及在真核细胞中的表达

目的：构建人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）18型E7联合小鼠次级淋巴组织趋化因子（Secondary lymphoid tissue chemokine，SLC）真核共表达基因，以获得高效性治疗HPVl8感染及相关肿瘤的DNA疫苗。方法：分别以HPVl8型的中国野毒株、pDsRed2-N1-SLC为模板，利用PCR克隆技术制备HPVl8E7和SLC基因，分别双酶切后胶回收获得HPVl8E7、SLC基因片段，分别插入到真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）和多克隆位点A（MCSA）中，构建pIRES-E7-SLC真核共表达质粒。酶切及核酸序列分析鉴定质粒。脂质体转染人脐静脉内皮细胞（ECV）细胞，以Western bolt方法鉴定真核表达质粒E7的表达，用ELISA的方法鉴定真核表达质粒SLC的表达。结果：酶切及核酸序列测定表明真核表达质粒pIRES-E7-SIC的成功构建。RT-PCR和Western-Blotting方法证实E7及SLC蛋白在真核细胞的正确表达。结论：成功地构建真核表达质粒plRES-E7-SLC，用它转染ECV细胞后，能表达E7和SLC蛋白，为下一步研究HPVl8感染及相关肿瘤疫苗奠定了基础。     

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人雌激素受体β(ERβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβcDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平。结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布。结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节剂和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础。     

转染CD147干扰质粒肝癌细胞7721的鉴定

目的构建CD147干扰质粒,对肝癌细胞7721内源性CD147表达的抑制效果进行检测。方法设计及构建3对pGenesil-1-CD147/shRNA及1对阴性对照干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用Lipofec-tamineTM2000转染肝癌细胞,通过瞬时转染获得细胞系,实时PCR和蛋白印迹法检测3对干扰质粒、阴性对照质粒的mRNA及蛋白表达水平。结果实时PCR和蛋白印迹法结果显示干扰质粒pGenesil-1-CD147/shRNA3对肝癌细胞7721内CD147mRNA及蛋白的抑制效果最显著。结论成功构建了CD147干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究低表达CD147的肝癌细胞7721在肝癌发生发展中的机制提供基础。     

NTE酯酶活力域真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经病变靶标酯酶（NTE）酯酶活力域（NESP）真核表达载体，并在细胞中表达。方法利用含有特定酶切位点的引物，通过PCR扩增出其酯酶活力域，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收cDNA片段定向插入到pcDNA3．1（＋）中，通过酶切鉴定其真核表达载体的构建。然后将其转染到真核细胞中，通过NTE活力测定，检测其表达效果。结果经PCR获得了NTE的1．6kb酯酶活力域的cDNA片段，T载体克隆后测序证实完全正确，然后克隆到真核表达载体中获得了NTE酯酶活力域真核表达载体pcDNA—NEST。瞬时转染到COS7和SH-SY5Y细胞中，NTE的活力与对照细胞相比显著提高。结论成功构建了NEST真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达。     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。