粉纹夜蛾类Cry1Ac受体氨肽酶N cDNA片段的克隆与分析

设计简并引物,采用RT-PCR方法对粉纹夜蛾Trichoplusia ni (Hübner)细胞系BTI-TN5B-4的氨肽酶N (aminopeptidase N, APN)基因cDNA片段进行了克隆和序列分析, 通过两对引物扩增出了两种氨肽酶N基因的cDNA片段, 大小分别为188 bp 和564 bp,分别命名为AS188（GenBank登录号: CD809324）和AS564（GenBank登录号: CD809326）。对这两个片段推导的氨基酸序列进行同源性分析, 结果表明两者与已报道的鳞翅目昆虫中肠的Cry1Ac 毒素受体氨肽酶N有较高的同源性。     

棉铃虫中肠氨肽酶APN4与Cry1Ac、Cry2Aa结合能力的比较

【目的】Bt杀虫蛋白(Bacillus thuringiensis)具有高度的靶标特异性,已经被广泛用于农业害虫防治。Bt杀虫蛋白要发挥杀虫活性,必须首先与其受体蛋白结合,氨肽酶N(Aminopeptidase N)是一类重要的Bt受体蛋白。因此,分析该受体与Bt杀虫蛋白的结合能力,可为进一步明确不同Bt的分子作用机制、Bt的抗性治理以及新Bt的开发应用等提供借鉴。【方法】本文利用Ligand blot和Elisa方法比较了棉铃虫Helicoverpa armigera中肠APN4(Aminopeptidase N4,APN4)与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力。【结果】原核表达的APN4片段与活化的Cry1Ac、Cry2Aa都可以结合,解离常数(Kd)分别是48.59 nmol/L和21.73 nmol/L。【结论】APN4片段与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力在数量级上不存在显著性差异。     

家蚕氨肽酶和类钙粘蛋白与苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素相互作用

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis生产的晶体毒素被广泛用作农林害虫的杀虫剂。鳞翅目昆虫受体蛋白是阐明其与晶体毒素相互作用的重要模式。文中纯化了苏云金芽孢杆菌的晶体毒素蛋白,质谱鉴定为Cry1Ac毒素,然后重组表达家蚕氨肽酶N (BmAPN6) 和类钙粘蛋白 (CaLP) 结合结构域。利用免疫共沉淀、Far-Western印迹和酶联免疫吸附试验,证明Cry1Ac毒素蛋白和BmAPN6之间的相互作用。在Sf9细胞中,对Cry1Ac毒素的细胞毒活性分析,表明BmAPN6参与Cry1Ac毒素诱导的细胞形态异常和裂解死亡。文中也利用相同的方法,对钙粘蛋白的3个结合位点CR7、CR11和CR12进行相互作用分析,结果表明3个重复结构域是CaLP的Cry1Ac结合位点。上述结果表明,BmAPN6和CaLP可作为Cry1Ac毒素致病的功能性受体,为进一步揭示晶体毒素的致病机制和基因编辑增强家蚕抗病性提供了研究靶标。     

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1AC毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1C产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。     

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1Ac 毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1c 产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N（aminopeptidase N, APN）和钙粘蛋白（cadherin）是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles, BBMV）上Bt毒素Cry1A的受体。本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapn1和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA（dsRNA）注入棉铃虫4龄幼虫体内, 以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。结果表明: 注射dsRNA（1 μg/头）进行基因沉默后, Haapn1 mRNA表达量比注射缓冲液（elution solution, ES）的对照下降了30%~49%, Ha_BtR mRNA表达量下降了30%~37%。注射Haapn1 dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm² Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫, 而在 100 和 170 μg/cm² Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异; Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异。当同时注射Haapn1及Ha_BtR dsRNA后, 干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降。本研究进一步证明了棉铃虫Haapn1和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体, 这两种受体蛋白共同参与Cry1Ac的毒杀作用过程。该结果也提示, Haapn1或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对Cry1Ac产生抗性。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(cadherin)是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)上Bt毒素Cry1A的受体.本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA(dsRNA)注入棉铃虫4龄幼虫体内,以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响.结果表明:注射dsRNA(1 μg/头)进行基因沉默后,Haapnl mRNA表达量比注射缓冲液(elution solution,ES)的对照下降了30%～49%,Ha_BtR mRNA表达量下降了30%～37%.注射Haapnl dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm2 Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫,而在100和170 μg/cm2 Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异;Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异.当同时注射Haapnl及Ha_BtR dsRNA后,干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降.本研究进一步证明了棉铃虫Haapnl和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体,这两种受体蛋白共同参与Cry1Ae的毒杀作用过程.该结果也提示.Haapnl或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对CrylAc产生抗性.     

Bt Cry1Ac抗性粉纹夜蛾离体细胞与敏感细胞mRNA的差异显示

为了研究昆虫对Bt的抗性机制 ,以苏云金芽孢杆菌Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾离体细胞连续筛选 80代 ,获得了高抗性细胞。采用DDRT PCR技术比较了该抗性细胞与非选择敏感细胞mRNA的差异 ,经反向RNA斑点印迹杂交确证了 5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明 ,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区 ,两种ESTs(GenBank注册号 :S1 ,CF32 2 4 1 5 ;S3,CF32 2 4 1 7)与数据库中EST没有显著同源性 ,另一种S2(GenBank注册号 :CF32 2 4 1 6)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的R1 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 3)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶有 60 %～63%的同源性 ,从抗性细胞特有的R2 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 4)推导出的氨基酸序列与黏蛋白类有约 30 %的同源性。这些差异表达基因可能与抗性的形成相关。     

粉纹夜蛾细胞中Bt Cry1Ac选择抗性的研究及离体品系与毒素结合的比较

采用Bt Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1细胞进行56代筛选后获得了抗性比为1280倍的抗性细胞。ELISA检测表明抗性细胞总蛋白和膜蛋白结合的Cry1Ac数量都少于敏感细胞。配体结合Western杂交实验显示：抗性细胞和敏感细胞的膜蛋白与总蛋白都有5条电泳迁移率相同的毒素结合多肽带,其分子量分别为207,158．5,118.8,72,38．5 kD;抗性细胞的118．8和72kD的阳性带比敏感细胞的略弱,这可能与抗性的形成相关。     

小菜蛾碱性磷酸酶基因cDNA片段的克隆及其序列分析

利用DNAman设计简并引物,通过反转录一多聚酶链式反应(RT-PCR)克隆小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗性、敏感种群中可能与苏云金芽孢杆菌(Bt)抗性相关的碱性磷酸酶基因。琼脂糖电泳结果显示扩增条带与预期片段长度一致,阳性克隆经测序获得了403bp的基因片断。经blast比较得出所克隆基因属于碱性磷酸酶基因。与敏感种群相比,抗性种群中该基因片段有18个碱基发生变化,有1个氨基酸发生替换(缬氨酸转变为苏氨酸)。研究结果对于进一步研究小菜蛾全基因结构、功能有重要的意义。     

藏酋猴达菲抗原/趋化因子受体基因的克隆与序列分析

利用GenBank公布的恒河猴达菲抗原/趋化因子受体基因(FY)核苷酸序列设计2对特异引物,采用PCR方法克隆藏酋猴Macaca thibetana FY基因,分别得到1.0kb和1.1kb的DNA片段,通过DNA测序和序列拼接获得藏酋猴FY基因1491bp片段,该片段包含2个外显子(21bp和990bp)和1个内含子(480bp)。该基因开放阅读框长1011bp,编码336个氨基酸,该蛋白等电点是5.77,分子量是35.52kDa,分子半衰期30h,不稳定指数是39.84,总平均疏水性是0.689,是疏水性蛋白。拓扑结构预测显示该基因编码氨基酸有15个潜在的功能位点:3个N-糖基化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个N-肉豆蔻酰化位点。整个蛋白质多肽链含有7个跨膜螺旋区,4个细胞外区和4个细胞内区。同源性比较结果显示,与人、恒河猴、牛、兔、犬、大熊猫6个物种FY基因编码区核苷酸序列间同源性分别为94.7%、99%、75.2%、80.2%、74.5%、71.7%,氨基酸序列间同源性分别为92%、99%、89.8%、78.2%、90%、89.3%。系统进化树结果表明:藏酋猴与恒河猴亲缘关系最近,与人类亲缘关系较近。     

家蝇气味结合蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

根据同源性设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出了家蝇Musca domestica 2种气味结合蛋白基因cDNA片段,大小分别为381 bp和353 bp,分别命名为MdomOBP1(GenBank登录号：AY730350)和MdomOBP2(GenBank登录号：AY730351)。测序分析结果表明,它们具有气味结合蛋白的标志性结构域。对这2个片段推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果表明两者与已报道的双翅目昆虫的气味结合蛋白的同源性分别达57%～88% 和52%～91%。     

马铃薯Y病毒p1基因的克隆与序列分析

利用依据马铃薯Y病毒(PVY)p1基因序列设计合成的一对引物YP1,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0．83kb的目的条带,测序结果表明为PVY p1基因。通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64％～94％间。依据P1蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析。     

大熊猫苦味受体T2R2 基因的克隆与序列分析

Based on bitter taste receptor T2R2 gene sequence of domesticated dog(AB249685), one pair of primers were designed and used to amplify an approximately 1.1 kb DNA fragment from genomic DNA sample of giant panda by using PCR. The PCR products were ligated into the pMD-18T vector, and then transformed into competent cells of E.coli DH5α. The identified positive clone was sequenced. The result showed that the T2R2 gene of giant panda was 1 008 bp in length, and contained complete exon, and 915 bp, encoding 304...     

一些化学物质对苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素与昆虫离体细胞相互作用的影响

为探讨苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）杀虫晶体蛋白与昆虫细胞的相互作用,以Bt Cry1Ac毒素和对该毒素敏感的粉纹夜蛾Trichoplusia ni离体细胞BTI-TN-5B1-4为材料,研究了一些化学物质对Cry1Ac毒素与昆虫离体细胞相互作用的影响.结果表明：N-糖基化抑制剂衣霉素、蛋白质合成抑制剂放线菌酮、胞吞作用抑制剂莫能菌素和胰蛋白酶预处理,都能不同程度地提高BTI-TN-5B1-4细胞对Cry1Ac毒素的敏感性,其中胰蛋白酶预处理的作用最明显;而N-乙酰半乳糖胺不能抑制Cry1Ac毒素对这种离体细胞的毒力.     

粉纹夜蛾颗粒体病毒增效基因3'端2.5 kb片段在大肠杆菌中的表达

将粉纹夜蛾Trichoplusia ni颗粒体病毒增效基因3'端2.5 kb片段插入pQE-31中构建了重组表达载体pQE/enhancin,转化大肠杆菌M15(pREP₄)在IPTG诱导下成功表达出分子量约为96 kD的融合蛋白并命名为P96。初步纯化的P96显示了明显的增效活性,可提高棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫3龄幼虫感染死亡率27.40%～34.50%,缩短LT₅₀ 1.9天以上。     

粉纹夜蛾细胞系QB—Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究

对粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞系QB-Tn9-4s进行细胞克隆,获得了8个细胞克降株,分别命名为QB-Tn-A、B、C、D、E、F、G和H.对基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定,各细胞克隆株与原始细胞系具有相同的DNA扩增谱带.各细胞克隆株在形态和生物学特性方面表现出一定的差异.克隆株QB-Tn-A、B、c、D和E以梭形细胞为主,大约占细胞总数的60%～80%;F、G和H以棒状细胞为主,比例分别为44.5%、49.5%和80.O%.8个克隆株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)均较敏感,感染率均在92%以上,平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量在78～110个之间,其中克隆株QB-Tn-A多角体产量最高达110个,略高于BTI-Tn5Bl-4和QB-Tn9-4s,明显高于Sf-9细胞;克隆株QB-Tn-E、H、A和C的fIJ芽性病毒(BV)产量与原始细胞系(3.37×107TCID50/mL)接近,而其它4株均低于原始细胞系.