溶血性曼氏杆菌PCR检测方法的研究

溶血性曼氏杆菌是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌。为快速、准确诊断由本菌导致的疾病 ,从基因库中获得溶血性曼氏杆菌( M.haemolytica )的基因序列 ,再从其基因序列中获得与其它细菌包括 M.annheimiagranulomatis,M.varigena ,M.ruminalis,M.glucosidal ,M.annheimiaspp和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段 ,设计成引物 ,建立了特异性好、敏感性高的 M.haemolytica PCR检测方法。结果表明 ,除溶血性曼氏杆菌为阳性外 ,其余所有细菌均为阴性 ,特异性为 1 0 0 % ,最小检出量为 8× 1 0 2 cfu/ m L 曼氏杆菌或 1 / 1 0个单个菌落。检验人工感染牛 ,检出率为 75%。此PCR检测方法的建立 ,为 M.haemolytica提供了一个快速诊断方法     

绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测绵羊肺炎支原体(MO)和溶血性曼氏杆菌(Mh)的方法,本研究根据MO的hsp70基因和Mh的gcp基因分别设计引物,建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法.实验结果显示该方法能够特异性的扩增MO (135 bp)和Mh (227 bp) DNA片段,其最低检出量分别为2.06×103拷贝/μL和6.37 c fu/mL,与单一PCR相同.该方法对常见的致病菌无交叉反应.对临床样本的检测结果显示MO和Mh的检出率分别为56.25％和52.50％,与单独PCR符合率为100％.研究结果表明,本研究所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点,为临床上MO和Mh混合感染的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法.     

溶血性曼氏杆菌致病机制的研究进展

曼氏杆菌病是牛、羊等反刍动物的重要呼吸道传染病,给养牛和养羊业带来较大的经济损失,溶血性曼氏杆菌是该病的病原,作者对其生物学特性、临床症状、毒力因子、致病机制等进行简要概述,为进一步深入研究提供参考。     

云南羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

采用PCR鉴定、16S rDNA基因鉴定方法,对从云南某羊场病羊肺脏中分离到的1株革兰氏阴性小球杆菌进行系统鉴定,并对分离株的致病性和药物敏感性进行研究。鉴定结果表明:分离株溶血性曼氏杆菌PCR鉴定为阳性;分离株16S rDNA基因序列与GenBank上公布的其它溶血性曼氏杆菌同源性为96%~99%,与溶血性曼氏杆菌D171参考株同源性高达99%,因此将分离株系统鉴定为溶血性曼氏杆菌。致病性实验表明:分离株对小白鼠有致病性,该分离株对头孢呋辛、头孢曲松等头孢类抗生素和四环素最为敏感。本研究为我国南方省份曼氏杆菌病的防控和深入研究奠定了基础。     

羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

对陕西省关中某奶山羊养殖场呼吸道症状引发死亡的羔羊进行病原检测.无菌采集死亡羔羊肺脏组织接种50 mL/L绵羊血琼脂平板,分别置于恒温培养箱与厌氧培养箱中36℃±1℃培养24 h,厌氧培养平板无菌生长,恒温培养血平板上可见大量溶血的灰白色、半透明的圆形菌落,挑取单菌落纯化培养后对分离株进行染色镜检、生化鉴定、16S r...     

2株山羊溶血性曼氏杆菌鉴定与分型

为了研究感染羊引起肺炎的溶血性曼氏杆菌的分子特征,分别从2只山羊肺部分离细菌,在血琼脂平板上分离纯化后,经培养、革兰染色镜检、生化试验、16S rDNA序列鉴定,结合临床症状鉴定这2株细菌为溶血性曼氏杆菌,分别命名为NH1、NH2。采用PCR方法,对2株溶血性曼氏杆菌进行血清型1型、2型和6型的鉴定,结果2株细菌均为血清型2型。采用多位点序列分型法对2株溶血性曼氏杆菌的7个管家基因扩增并测序,结果等位基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf的序号分别为1、1、3、1、1、1和4, 2株分离菌序列型一致,均是ST46。通过纸片扩散试验检测细菌对抗菌药物的敏感性,MH1对链霉素耐药,对多西环素和妥布霉素中介,对其他13种药物均敏感;MH2对链霉素中介,对其他15种药物均敏感。     

1例疑似溶血性曼氏杆菌感染的诊断及生物信息学分析

试验旨在研究溶血性曼氏杆菌的生物学特性,以新疆阿克苏市某羊场疑似感染溶血性曼氏杆菌的绵羊为研究对象,对其感染情况和发病症状进行调查记录;解剖病死羊,无菌采集组织脏器,通过普通PCR法对病料进行实验室病原学诊断,同时对溶血性曼氏杆菌基因及其蛋白特性进行生物信息学分析。结果显示,病死羊肺脏充血、出血、实变,肠道出血、淋巴结肿大;巴氏杆菌PCR、16S rRNA检测结果均为阳性,该病例最终诊断为溶血性曼氏杆菌感染。生物信息学分析结果显示,该蛋白为亲水性蛋白,具有54个磷酸化位点,二级结构为其结构连接5个α-螺旋。研究表明,该羊场羊感染溶血性曼氏杆菌。     

绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

为了对引起绵羊肺炎的病原进行分离、鉴定和耐药性分析,本研究通过无菌采集绵羊肺脏并对细菌进行分离纯化、生化试验和PCR鉴定,然后对所得到的溶血性曼氏杆菌分离株进行药物敏感性研究。结果显示,分离纯化得到的细菌为革兰氏阴性短杆菌,具有弱溶血性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;耐药性分析显示该菌株对恩诺沙星、庆大霉素、四环素等大部分药物敏感。本研究为绵羊溶血性曼氏杆菌感染的有效防制提供有用的信息和数据。     

牛源多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立与应用

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10⁵,1.98×10⁶ copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测...     

西藏绵羊溶血性曼氏杆菌分离鉴定及药敏特性研究

为探究西藏自治区山南市某地农户饲养的绵羊大批死亡的原因,采集病死羊心脏、脾脏、小肠、肺脏、气管等病料,进行细菌培养、分离鉴定、PCR检测、血清型鉴定、毒力基因检测及药敏特性分析。结果显示:从病死羊肺脏病料中分离出一株溶血性曼氏杆菌,血清型为2型;特异性PCR检测为阳性,证明分离菌株为溶血性曼氏杆菌;药敏试验结果显示,分离的溶血性曼氏杆菌对大多数临床常用抗生素敏感;主要毒力基因lktA检测为阳性。该研究首次从西藏绵羊分离出溶血性曼氏杆菌,并研究了其药敏特性,为该病的诊断与治疗提供了参考。     

副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒的研制及初步应用

在特异性和敏感性试验的基础上,组装副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒,进行批间和批内试剂盒的检测、试剂盒在不同温度条件下的保存期试验等.结果表明,试剂盒特异性好、敏感性高,批内和批间的试剂盒无差异,试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月.适用于不同地区、不同条件的实验室快速检测副猪嗜血杆菌.     

弓形虫PCR检测试剂盒的组装和初步应用

研制弓形虫PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据GenBank公布的弓形虫MIC3基因序列,设计合成1对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性、稳定性和保存期进行研究,之后进行临床试验。该诊断试剂盒能扩增出弓形虫特异性基因MIC3片段,与猪球虫、贾第虫、猪旋毛虫和隐孢子虫无交叉反应;该检测方法最低能够检测到10个弓形虫速殖子的DNA,不同批次的试剂盒对同一样品检测和同一批次对不同样品检测,有较高的重复性和稳定性,且常温下可保存1年以上,临床应用效果显著。该检测试剂盒对弓形虫病早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。     

猪水肿病PCR快速检测测试剂盒的研制

实验在大肠杆菌产生的志贺样毒素2型变异体(Shiga-like toxin Ⅱ e,Stx2e)研究的基础上,设计了一对特异性引物,通过优化,建立了以PCR为基础,高效快速检测猪水肿病的PCR试剂盒.该试剂盒扩增的阳性条带为172 bp的特异性DNA片段,最低检出菌体量为120 CFU,在-20℃至少可保存12个月,重复性良好.应用猪水肿病PCR快速检测试剂盒对22份新鲜样本进行了检测,结果显示,其中的5个样本含Stx2e阳性大肠杆菌,PCR检测结果与剖检、细菌学和生化检验结果相一致.     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测试剂盒的研制及应用

为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型（FAdV-4）检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术（LFD）,优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克病病毒（MDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H9亚型（AIV（H9））、禽呼肠孤病毒（ARV）、FAdV标准株（FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11）、鸡大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（SA）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、鸡毒支原体（MG）的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4 ℃条件下至少可以保存3个月,在-20 ℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%（21/117）。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。     

Mannheimia granulomatis PCR检测方法的建立

Mannheimia granulomatis是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌.为快速、准确诊断由该菌导致的疫病,从基因库中获得M.granulomdtis的基因序列,再从M.granulomatis的基因序列中获得与其他细菌包括溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段,设计引物,建立了特异性好、敏感性较高的M.granulomatis的PCR诊断方法.结果表明,其特异性为100%,最小检出量为5×104cfu/mL～5×103cfu/mL M.granulomatis或1/10个单个菌落.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒的研制

根据GenBank中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因序列,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为600 bp,特异性与敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为50 CFU/mL,而对金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。-20℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对41份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与细菌学检测结果相一致。结果表明,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒能够对APP临床样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

牛结核病PCR检测试剂盒的研制

根据GenBank中的牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒,该试剂盒扩增的阳性条带为317 bp;敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为1.025 pg/μL;特异性试验表明,仅结核分枝杆菌扩增结果为阳性,副结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌的扩增结果均为阴性。-20 ℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对24份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与结核菌素试验检测结果相一致。结果表明,牛结核病PCR检测试剂盒能够对牛结核临床样本进行快捷、灵敏、准确的检测。     

猪水肿病PCR快速检测试剂盒的研制

实验在大肠杆菌产生的志贺样毒素2型变异体（Shiga—like toxinⅡe,Stx2e）研究的基础上,设计了一对特异性引物,通过优化,建立了以PCR为基础,高效快速检测猪水肿病的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为172bp的特异性DNA片段,最低检出菌体量为120CFU,在-20℃至少可保存12个月,重复性良好。应用猪水肿病PCR快速检测试剂盒对22份新鲜样本进行了检测,结果显示,其中的5个样本含Stx2e阳性大肠杆菌,PCR检测结果与剖检、细菌学和生化检验结果相一致。