一条人脑胶质瘤相关新基因的克隆与表达

目的运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因，并对其中一条与脑胶质瘤相关的新基因进行了克隆和表达的研究。方法抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针，经杂交、洗涤后，通过计算机观察二者表达谱的差异情况，对681F05克隆子进行了Northern blot，生物信息学分析和蛋白质的表达。结果通过四次基因芯片筛选，获得15条与胶质瘤相关的新基因，经northern blot证实681F05基因在人正常脑组织中低表达，而在人脑胶质瘤中高表达。BLASTn和BLASTx分析显示，它们编码蛋白与线虫Cyp-10蛋白同源性分别为52％和72％。cDNA序列分析发现这两个克隆是同一个基因[命名为cyclophilin—like gene（PPIL3）]的两个不同的剪切体（PPIL3a和PPIL3b）。并在大肠杆菌中得到了PPIL3a和PPIL3b与GST较好表达的融合蛋白。结论基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少，高质量，高速度，高敏感等特性。681F05基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。     

采用基因芯片技术获取人脑胶质瘤差异表达的基因及一条全长新基因的研究

目的：运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中一条基因进行了初步的研究。方法：抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机二者表达谱的差异情况,对436F11克隆子进行了northern blot,原位杂交和生物信息学分析。结果：通过四次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经northern blot证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达。原位杂交得到相同的结果。BLASTn和BLASTx分析显示,436F11基因为全长新基因,其编码78个氨基酸,其理论分子量为8648Da,等电点为4．69,与鼠PKIβ69%同源,命名为人PKIβ。结论：基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少、高质量、高速度、高敏感等特性。人PKIβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因,这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路。     

人脑胶质瘤相关的二条全长新基因报导及染色体定位

目的 报导与人脑胶质瘤相关的二条新基因及其在染色体上的定位。方法 对发现的脑胶质瘤相关的二条新基因进行测序，Northern blot和序列局部对比查询（BLAST）分析，同时运用染色体辐射杂交（RH）技术对其进行染色体定位。结果 这二条新基因都是全长新基因，基因库登录号分别为AF225513和AF329277。经Northern blot证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达，而另一条基因507 E08则相反。RH染色体定位显示436F11基因在6q21-q23的D6S304和D62S2156 Marker之间，507E08基因在D14S1066Marker和D14S265 Marker之间。结论 找到了二条与人脑胶质瘤相关的全长新基因及其在染色体上的相应定位，这为胶质瘤的基因治疗提供了新思路。     

胶质母细胞瘤基因表达谱及相关基因的聚类研究

目的探讨人脑胶质母细胞瘤发生、发展中相关基因的表达及功能.方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型表达谱芯片,以正常成人脑及不同级别胶质瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray 4000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质瘤组织差异基因并进行生物信息分析;用Hierarchical聚类对胶质瘤差异基因进行特征提取;用Northern杂交验证及进行初步功能研究.结果正常脑与18例不同级别胶质瘤组织间筛选出多类差异表达基因,通过生物信息学和Hierarchical聚类,发现α-连环素、微型染色体维护蛋白7、细胞周期素B2、FBX05、着丝粒蛋白F基因与胶质母细胞瘤密切相关,该类基因在低级别胶质瘤中表达差异不明显,但胶质母细胞瘤中表达明显上调.Northern杂交显示该类基因与胶质母细胞瘤密切相关,与芯片结果一致.结论基因表达谱芯片可快速、高效地筛选胶质瘤相关基因,发现的5条基因与胶质母细胞瘤侵袭性强密切相关,可成为判断胶质瘤预后的分子生物学指标.     

人BTBD10新基因克隆及组织表达和在脑胶质瘤中的表达谱及聚类

目的探讨人脑胶质瘤相关BTBD10新基因克隆、正常成人组织分布及在不同级别星形细胞瘤中的表达。方法构建胎脑cDNA文库和大规模测序获得全长BTBD10新基因;用Clontech人多组织文库(MTC)为模板研究BTBD10在8种正常组织中的分布;用含13 939种人类基因(8 347种已知基因,5 592种未知基因)的BioStarH140S型表达谱芯片检测BTBD10在星形细胞瘤中的表达,Hierarchical聚类分析与BTBD10表达谱相近的基因群;Northern杂交验证BTBD10在不同级别胶质瘤中的表达。结果人胎脑文库中克隆的BTBD10新基因含1 428bp长的开放阅读框,编码475个氨基酸的蛋白;芯片结果提示BTBD10基因在18例胶质瘤组织中表达一致降低,与促性腺诱导素转录阻抑蛋白GIOT1、血管性肠肽VIP等7条基因的表达谱相似;BTBD10在正常脑组织中表达量最高,而心、肺、肝、肾、胰腺中表达较低;Northern显示BTBD10与胶质瘤发生密切相关,与芯片结果一致。结论表达谱芯片可快速高效筛选脑胶质瘤相关基因,BTBD10基因与胶质瘤发生密切相关,在脑胶质瘤的转录调控中起重要作用。     

miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的 影响

目的 探究miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的影响以及其可能机制.方法 利用miRNA芯片筛选出在神经胶质瘤细胞U251和人脑正常胶质细胞HEB中差异表达的miRNA;化学合成法制备miR-92b抑制剂,转染后用real-time PCR技术验证表达变化;CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力;划痕实验和Transewll实验检测转染后细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、β-catenin和E-cadherin的表达;荧光酶素实验验证IGFBP-3是否为miR-92b的靶基因.结果 基因芯片结果显示miR-92b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于人脑正常胶质细胞(P<0.05);CCK-8实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞增殖能力降低(P<0.05);划痕实验和Transwell实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.05);Western blot结果显示抑制miR-92b后,IGFBP-3和E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),β-catenin表达减少(P<0.05);荧光素酶实验结果显示,miR-92b能直接靶向调控IGFBP-3.结论 miR-92b在神经胶质瘤中表达显著增加,其可能通过抑制IGFBP-3蛋白表达,从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭.     

人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中NOTCH-1信号通路的调控

背景：研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用。 目的：探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用。 设计、时间及地点：开放性实验,于2005-01/2007-03在解放军第三军医大学新桥医院完成。 材料：人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供。U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠;CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠。 方法：取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133+脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2 h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色。 主要观察指标：人脑胶质瘤干细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达。 结果：在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24~48 h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4 h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24 h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层。肿瘤球能同时表达干细胞标志物CD133和巢蛋白,CD133+脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3~3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点。NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织（P < 0.01）,在CD133+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP+和MAP2+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP+ U251及CHG-5胶质瘤细胞中呈弱表达或不表达。在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA及NOTCH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱。 结论：NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达。NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控。     

人脑胶质瘤中IKKε的表达及其意义

目的探讨IKKε基因在人脑胶质瘤组织中的表达及其意义。方法收集具有明确病理分级的51新鲜胶质瘤标本,其中Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤24例,Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤27例,并取7例内减压去除的脑组织标本作为对照。采用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测IKKεmRNA和蛋白水平的表达,免疫组化染色确定IKKε的细胞定位,研究IKKε蛋白表达与胶质瘤病理分级的关系。结果 IKKεmRNA水平(t=23.734,P0.05)和蛋白水平(掊2=12.583,P0.05)在人胶质瘤中的表达显著高于对照脑组织,在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ级组(t=21.587,P0.05)。Western blot结果显示7例对照脑组织6例无IKKε表达(6/7),24例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤3例中/高表达,27例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤23例中/高表达。IKKε的表达与人脑胶质瘤病理分级呈正相关(r=0.513,P0.05)。免疫组化染色显示IKKε阳性反应物主要位于胞浆。结论IKKε在人脑胶质瘤中呈高表达,IKKε的表达与人脑胶质瘤的病理分级相关,可能与人脑胶质瘤的发生及恶性进展有关。     

人脑胶质瘤免疫抑制因子TGFβ_2及TGFβ_1的基因表达

目的　研究人脑胶质瘤主要免疫抑制因子转化生长因子TGFβ2 及TGFβ1的基因表达与其胶质瘤恶性程度的关系。方法　采用Northern杂交、免疫组化和Western杂交法检测了 5 0例胶质瘤、3例恶性胶质瘤体外细胞系和 8例正常脑组织TGFβ2 的表达水平。同时检测其同型异构体TGFβ1的表达水平。结果　正常脑组织几无TGFβ2 和TGFβ1表达 ,而胶质瘤均表达 2 .8和 /或 5 .1kb的TGFβ2 mRNA片段和约 2 5 0 0 0u及 30 0 0 0u的蛋白 ;TGFβ2 和TGFβ1表达水平随肿瘤恶性程度增高而增高。结论　TGFβ2 和TGFβ1表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关 ,TGFβ2 和TGFβ1可作为恶性胶质瘤免疫基因治疗的候选基因。     

基因芯片在人脑星型细胞瘤基因研究中的初步应用

目的:探索基因芯片在人脑胶质瘤基因表达研究中的应用。方法:通过ＲＴ－ＰＣＲ反转录、同位素标记、基因芯片方法研究５例星型胶质瘤和４例正常脑组织ｍＲＮＡ的表达差异。结果:在 １４ ８９２个可表达顺序片断(ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ,ＥＳＴ)中,对照与２个胶质瘤样品间有１０２个差异表达。对照与３级样品间共有３９个显著差异表达基因,与４级样品间共有７８个显著差异表达基因,３级和４级肿瘤有５个共同异常表达基因。结论:基因芯片发现了胶质瘤的异常基因表达谱。     

星形细胞瘤的基因表达谱和Hierarckcal聚类研究

目的 探讨人脑星形细胞瘤发生发展中相关基因及分类特征基因的表达。方法 用含13939种人基因的BioStarH140S芯片，以正常脑及18例胶质瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片，ScanArray4000扫描信号，提取脑及不同级别星形细胞瘤的差异基因并行生物信息分析，Hierarchical聚类提取差异基因的特征。结果 星形细胞瘤中筛选出438条(3．14％)差异表达基因；信息分析与细胞信号、细胞骨架和运动、癌基因及抑癌基因等多类基因密切相关；与分类相关的特征基因有MAP7、DBCCR1、PCDHA5、KCNAB1、NAPIL2等。表达谱将星形细胞瘤分成两类，与临床组织病理分类基本一致。结论 芯片是基因分析和筛选肿瘤标志性基因的有效手段，可客观分析星形细胞瘤发展及预后；分类特征基因为星形细胞瘤侵袭性和预后判断提供依据，有助于临床诊治。     

利用基因芯片研究与胶质母细胞瘤侵袭性相关的基因

目的探讨利用基因表达谱芯片筛选人脑胶质母细胞瘤与侵袭性相关基因的表达及功能。方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型芯片,以成人脑及6例胶质母细胞瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray4 000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质母细胞瘤组织差异基因,并进行生物信息分析及功能研究。结果表达谱芯片筛选出胶质母细胞瘤差异基因198条(1.42％),与细胞信号和传递蛋白、细胞骨架、代谢、蛋白翻译合成、细胞周期蛋白类、癌基因和抑癌基因等多类基因密切相关;与侵袭性相关的8条细胞骨架和细胞外基质基因表达谱相似,均在胶质母细胞瘤中显著上调,生物信息分析为α-连环素基因、钙粘附素1基因、层粘连蛋白、纤连蛋白1基因、基质金属蛋白酶2、Ⅲ型胶原基因、组织金属蛋白酶抑制1基因和血小板衍生生长因子受体A基因。结论表达谱芯片是高通量筛选胶质瘤相关基因的生物高新技术,侵袭性相关基因为判断胶质母细胞瘤患者的预后提供了分子生物学指标,有助于临床诊治。     

人脑胶质瘤组织BIRC2表达变化及临床意义

目的 探讨人脑胶质瘤组织含杆状病毒IAP重复蛋白2（BIRC2）表达变化及临床意义。方法 从GEO数据库获取人脑胶质瘤的基因表达芯片进行差异表达基因分析,并借助TCGA数据库对筛选出的BIRC2基因在人脑胶质瘤中的表达及预后进行分析,同时通过GSEA分析BIRC2在人脑胶质瘤中的作用机制进行预测。结果 从GEO数据库筛选GSE66354芯片中筛选出BIRC2为上调表达基因。TCGA数据库分析结果表明,BIRC2在多形性胶质母细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织（P<0.05）,预后分析表明BIRC2高表达胶质瘤病人预后更差（P<0.05）,GSEA分析显示BIRC2的作用主要发生在蛋白质翻译启动等过程。结论 本文结果提示BIRC2可能与人脑胶质瘤的发生、发展有关,检测BIRC2基因可用于评估人脑胶质瘤病人预后。     

Differential expression of glial fibrillary acidic protein in human glioma cell lines

Summary We have obtained a cDNA fragment to human glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunoscreening a gt11 human brain cDNA library with antibody to bovine GFAP. The highly homologous nucleotide sequence of this clone with that of the mouse GFAP enabled the identification of this cDNA as one encoding GFAP. As this cDNA hybridized with a single major RNA species in Northern blots of RNA from human and mouse brain tissues and gave one or two bands in Southern blots of human genomic DNA, it was considered to be specific for GFAP. Using this cDNA as a probe we investigated the levels of GFAP expression in ten human glioma cell lines. A 3.5-kb GFAP mRNA was detected in five of the ten glioma cell lines, one of which was U-251 MG cell line and the other four were clones derived from the same tumor (CL1, 2, 3, and 4). There was a difference in the amount of GFAP mRNA among U-251 MG and the four clonal cell lines. Quantitative evaluation of this difference by RNA dot blot analysis revealed that the amount of GFAP mRNA expressed in CL3 was about 1/5 and in CL4 about 1/10 the amount expressed in U-251 MG, CL1, and CL2. Semiquantitative Western blot analysis showed that GFAP levels corresponded to the GFAP mRNA levels in these cell lines. By Southern blot analysis of genomic DNA the GFAP gene was similarly detected in all of these cell lines regardless of the level of GFAP expression. Thus, by using a cDNa to human GFAP we have demonstrated the presence of clonal cell lines from human glioma showing different levels of GFAP expression, which may provide a useful basis for further investigations on the regulation of GFAP gene expression in glial cells.     

Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays

In order to identify novel genes involved in appetite and body weight regulation we have developed a microarray based method suitable for detecting small changes in gene expression in discrete groups of hypothalamic neurons. The method is based on a combination of stereological sampling, laser capture microdissection (LCM), PCR based amplification (SuperAmp), and one-color cDNA microarray analysis. To validate the method we assessed and compared fasting induced changes in mRNA levels of Neuropeptide Y (NPY) and proopiomelanocortin (POMC) in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC) of diet-induced obese rats using cDNA microarrays, quantitative PCR and in situ hybridization. All methods revealed statistically significant fasting-induced changes in NPY and POMC expression. An additional 3480 differentially expressed probes (fold change >1.22, t-test p=0.05) were identified in the microarray analysis. Our findings demonstrate a consistent gene expression pattern across three different gene expression detection methods and strongly suggest that LCM coupled microarray analysis combined with SuperAmp can be used as a semi-quantitative mRNA profiling tool. Importantly, the sensitivity of the method greatly improves the usefulness of the microarray technology for gene expression profiling in non-homogeneous tissues such as the brain.     

Identification of tumor invasion-related differentially expressed genes in different grades and all-trans retinoic acid-treated astrocytoma cell lines

BACKGROUND:Although several genetic aberrations and gene expressional changes have been shown to exist in tumors and different grades of astrocytomas,as well as in normal tissues,the gene profiling and ge-netic pathways associated with malignant transformation and progression remain unclear. OBJECTIVE: To identify differentially expressed genes related to tumor invasion from various grades and all-trans retinoic acid (ATRA)-treated astrocytoma cell lines by cDNA microarray. DESIGN,TIME AND SETTING: In vitro...