黄花烟草K^＋通道基因NKC1克隆与序列分析

通过已知生物钾通道蛋白保守序列分析,设计兼并引物对钾饥饿处理的烟草幼根总RNA的反转录产物进行PCR扩增,分离到K^＋通道基因NKC1,该基因的cDNA阅读框由2481个核苷酸组成,编码的蛋白含有826个氨基酸（分子量为94.6KD）,等电点为6.60;将核苷酸序列输入NCBI进行BlastX其同源序列大部分为高亲和K＋转运体,与该基因同源性最高的是Solanum tuberosum钾通道基因SKT1,其氨基酸同源性为79%,预测该蛋白具有6个跨膜区域,采用同源模建方法预测了NKC蛋白活性区域的3维结构。同时,特异性转录分析发现NKC1基因在烟草幼根、叶片和花各器官均有表达,而以幼根组织中转录量最多;缺钾处理可显著诱导根系中NKC基因的转录,而高浓度NH4^＋处理对该基因的转录具有抑制作用,证实NKC基因在黄花烟草的钾吸收过程中起着重要作用。     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

钝裂银莲花Actin基因片段的克隆与序列分析

提取钝裂银莲花叶片中的基因组DNA,用来克隆其Actin基因序列片段,为研究其生理功能及其他基因在钝裂银莲花中的表达和调控奠定基础。根据GenBan中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物。以钝裂银莲花叶片总DNA为模板,利用RT—PCR技术获得了3个Actin基因片段。序列分析表明,3个Actin基因片段长为780bp,含有一段内含子,第一段外显子编码128个氨基酸,具有2个Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列同源性在81%-90％之间,氨基酸序列同源性在95％-100％之间。第二段外显子编码84个氨基酸,与其他植物同源性序列进行分析表明其氨基酸序列同源性在94％-99％之间。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为AOACTI,AOACT2,AOACT3。     

烟草Mlo基因的克隆及其序列特性分析

Mlo基因家族是一类植物抗病的负调控因子,该基因的突变能产生广谱的抗病性。以GenBank公布的水稻Mlo基因序列(登录号:AK099399.1)为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行拼接,最后得到了烟草Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因cDNA片段951 bp,该基因可编码304个氨基酸。采用生物信息学方法预测分析了该基因编码蛋白的一、二级结构,并对其功能进行了预测。结果表明,该烟草Mlo基因编码蛋白包含有一个保守的Tmemb_40结构域,可能是一种类似于植物G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白。     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

茶叶多酚氧化酶基因克隆与序列分析

以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号三个茶树品种为研究材料,采用同源克隆法,根据已克隆的植物多酚氧化酶基因的序列分析,设计特异引物,从三个茶树品种中克隆获得多酚氧化酶基因全长,分别编码595、599和597个氨基酸。序列比较分析表明,茶树多酚氧化酶基因的核苷酸序列同源性高于92.6%,氨基酸序列同源性高于94.6%,并包含两个富含组氨酸的铜离子保守区域。     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱