一个调控抗菌肽表达的小菜蛾肽聚糖识别蛋白(PxPGRP-SA)

【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是昆虫免疫系统中一类重要的模式识别蛋白。本研究旨在阐明经苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis侵染后,小菜蛾Plutella xylostella PGRP-SA基因(命名为Px PGRP-SA)在体内的表达模式和对抗菌肽基因的表达调控。【方法】本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析B.thuringiensis侵染小菜蛾幼虫后Px PGRP-SA的转录模式,通过RNAi技术结合抗血清封闭实验检测Px PGRP-SA对小菜蛾抗菌肽基因的表达调控作用。【结果】qRT-PCR检测表明,小菜蛾4龄幼虫在注射具有活性的B.thuringiensis 6 h后,Px PGRP-SA在脂肪体和血细胞中表达量迅速上升,其中脂肪体中的表达量在注射24 h后达到高峰,而在血细胞中的表达量在18 h后达到高峰。RNAi沉默小菜蛾4龄幼虫Px PGRP-SA的转录后,可显著降低小菜蛾脂肪体中cecropin,moricin-2,lysozyme和defensin 4个抗菌肽基因及Dorsal和Sptzle基因的mRNA转录水平;注射anti-Px PGRP-SA封闭小菜蛾体内Px PGRP-SA的活性后,也可降低小菜蛾脂肪体中4个抗菌肽基因的mRNA转录水平;Px PGRP-SA转录沉默后,同时导致添食B.thuringiensis的小菜蛾幼虫的存活率明显降低。【结论】Px PGRP-SA参与了小菜蛾体内抗菌肽cecropin,moricin-2,lysozyme和defensin基因的表达调控,并在免疫防御B.thuringiensis的侵染过程中起了重要的作用。     

肽聚糖识别蛋白PGRP-SC在家蝇肠道免疫中的功能分析

【目的】探究家蝇Musca domestica幼虫肽聚糖识别蛋白PGRP-SC在应对肠道入侵细菌中的作用。【方法】通过投喂表达Md PGRP-SC dsRNA的宿主大肠杆菌Escherichia coli干扰家蝇初孵幼虫Md PGRP-SC基因表达,并利用q PCR技术检测干扰效果;在荧光显微镜下观察干扰后试虫肠道内表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的大肠杆菌存活情况,同时通过比色法检测干扰后试虫肠道组织内的H2O2含量,利用q PCR检测试虫肠道内抗菌肽基因的表达情况。【结果】q PCR结果显示,投喂干扰24 h后家蝇幼虫体内Md PGRP-SC基因的相对表达量显著降低。对PGRP-SC干扰组和GFP对照组试虫投喂表达GFP的大肠杆菌,30 min后干扰组家蝇肠道内荧光亮度弱于GFP对照组。同时,干扰组试虫肠道内H2O2含量与空白对照或GFP对照组相比均没有显著差异,而干扰组中抗菌肽表达水平显著高于GFP对照组。【结论】Md PGRP-SC在控制家蝇幼虫肠道免疫敏感程度中起作用。     

非洲爪蟾中一种长型肽聚糖识别蛋白的克隆与表达分析(英文)

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是固有免疫系统中一类重要的模式识别受体。该文首次从两栖类模式生物-非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)中克隆得到了一个长型PGRP(XtPGRP-L)基因。XtPGRP-L具有5个外显子和4个内含子的基因组结构,该结构在进化的过程中比较保守。序列比对与系统进化分析显示XtPGRP-L具有保守的酰胺酶活性位点。蛋白质建模显示XtPGRP-L拥有保守的3-D结构。实时定量PCR检测显示,XtPGRP-L在非洲爪蟾胚胎早期不表达,到72h蝌蚪期开始表达。在成体的肝脏、肺、肠和胃高表达。同时,在LPS刺激后,XtPGRP-L在肝脏、肠和胃中呈明显上调表达。结果表明,XtPGRP-L在非洲爪蟾固有免疫系统中可能具有重要的作用。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因BdPGRP-SB1的克隆及功能鉴定

【目的】为探究肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因BdPGRP-SB1在桔小实蝇Bactrocera dorsalis免疫中的作用。【方法】本研究利用PCR克隆桔小实蝇BdPGRP-SB1全长cDNA序列;利用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列特征进行分析。采用RT-qPCR分析BdPGRP-SB1在桔小实蝇不同发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)及5日龄成虫不同组织(中肠、马氏管、后肠、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达模式;对桔小实蝇5日龄雌成虫分别注射大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus肽聚糖(PGN-SA)后检测BdPGRP-SB1表达水平变化。利用RNAi沉默BdPGRP-SB1的表达,测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后桔小实蝇雌成虫的死亡率及大肠杆菌诱导后抗菌肽(AMP)基因attacin-A, defensin和diptercin表达变化情况。【结果】克隆获得桔小实蝇BdPGRP-SB1的全长cDNA序列(GenBank登录号: MN892482),开放阅读框长558 bp,编码185个氨基酸,其编码蛋白预测分子量为21.45 kD,等电点为8.57。序列分析表明,BdPGRP-SB1无跨膜结构域,具有PGRP保守结构域,前端具有信号肽,为分泌型蛋白;具有Zn²⁺依赖性酰胺酶活性和DAP型肽聚糖识别位点。系统进化分析发现,BdPGRP-SB1与辣椒实蝇B. latifrons的PGRP-SB1亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达96%。发育表达模式表明,BdPGRP-SB1在桔小实蝇3日龄幼虫和成虫期高表达;组织表达谱结果显示BdPGRP-SB1在5日龄成虫各组织中均有表达,在脂肪体内表达量最高。PGN-EB和PGN-SA均能诱导桔小实蝇雌成虫体内BdPGRP-SB1表达水平变化。通过RNAi抑制BdPGRP-SB1表达后,注射大肠杆菌导致桔小实蝇雌成虫死亡率显著升高,以及attacin-A, defensin和diptercin表达量显著上调。【结论】结果说明桔小实蝇BdPGRP-SB1参与识别革兰氏阴性细菌,并可能参与桔小实蝇Imd途径调控其免疫反应。     

桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因BdPGRP-SB1的克隆及功能鉴定

【目的】为探究肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因BdPGRP-SB1在桔小实蝇Bactrocera dorsalis免疫中的作用。【方法】本研究利用PCR克隆桔小实蝇BdPGRP-SB1全长cDNA序列;利用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列特征进行分析。采用RT-qPCR分析BdPGRPSB1在桔小实蝇不同发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)及5日龄成虫不同组织(中肠、马氏管、后肠、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达模式;对桔小实蝇5日龄雌成虫分别注射大肠杆菌Escherichia coli0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus肽聚糖(PGN-SA)后检测BdPGRP-SB1表达水平变化。利用RNAi沉默BdPGRP-SB1的表达,测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后桔小实蝇雌成虫的死亡率及大肠杆菌诱导后抗菌肽(AMP)基因attacin-A,defensin和diptercin表达变化情况。【结果】克隆获得桔小实蝇BdPGRP-SB1的全长cDNA序列(GenBank登录号:MN892482),开放阅读框长558 bp,编码1...     

甜菜夜蛾肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能。【方法】利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达。通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后,qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin, Attacin和Defensin)和细菌载量的变化。RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后,以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0, 24, 48, 72, 96和120 h,计算幼虫校正死亡率;饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫Bt-GS57后0, 24, 48和72 h,利用qRT-PCR检测中肠SePGRP-SA, Ceropin, Attacin和Defensin的相对表达量。【结果】克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号：MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸,其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD。序列分析结果表明,SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域,信号肽为19个氨基酸,为分泌型蛋白;系统进化分析发现,SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的SlPGRP亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达91.1%。发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达;组织表达谱结果表明,SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达,其中以血淋巴中表达量最高。与注射dsEGFP(对照)相比,注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了95.26%,Cecropin, Attacin和Defensin表达量显著下调,中肠细菌载量显著升高。注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00%和73.33%,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加。甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后,中肠SePGRP-SA, Cecropin, Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加,72 h时降低。【结论】Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin, Attacin和Defensin的表达。     

大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的克隆及其功能研究

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒, 并对其功能进行了初步的研究。序列分析显示, 所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽; 其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点。Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外, 也可滞留在胞内。体外抗菌实验的结果表明, 过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖。此外, 过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性; 能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们。研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白。     

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。     

家蝇攻击素(Attacin)基因的克隆与表达

通过同源克隆策略并结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆到了编码家蝇攻击素(Attacin)基因的全长cDNA序列(GenBank登陆号：AY460106),并对相应的氨基酸序列进行了序列比对,对系统关系等进行了生物信息学分析。家蝇Attacin的cDNA全长778bp,其中包括627bp的开放式读码框(ORF),44bp的5’末端非编码区(5’UTR)和107bp的3’末端非编码区(3’UTR),相应的蛋白产物含208个氨基酸,与其他双翅目昆虫的Attacin具有很高的相似性,约50％-70％。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)所构建的系统关系表明,家蝇的Attacin与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先。应用半定量RT-PCR的方法,研究家蝇幼虫在受到外源刺激后Attacin基因的表达,结果表明,在家蝇幼虫体内Attacin基因呈诱导型表达,表达水平随诱导时间和诱导源的不同而变化。     

肽聚糖识别蛋白AaPGRP-LC参与埃及伊蚊的抗细菌免疫反应

【目的】阐明在响应细菌感染的过程中,埃及伊蚊Aedes aegypti体内肽聚糖识别蛋白PGRPLC(Aa PGRP-LC)的功能。【方法】使用实时荧光定量PCR(q PCR)技术分析埃及伊蚊感染阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae后不同时间抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)基因的表达情况。结合RNA干扰技术和q PCR技术检测干扰Aa PGRP-LC后免疫相关基因转录模式的变化。使用原核表达系统表达Aa PGRP-LC,并通过Ni~(2+)-NTA柱纯化,通过免疫印迹分析检测所纯化蛋白的质量。【结果】阴沟肠杆菌感染埃及伊蚊6 h后埃及伊蚊体内抗菌肽基因的转录水平显著升高。干扰Aa PGRP-LC并用阴沟肠杆菌感染后,埃及伊蚊体内重要抗菌肽基因的转录水平显著降低,同时埃及伊蚊免疫缺陷(immune-deficiency,IMD)通路和Toll信号(Toll-like receptors)通路的免疫相关基因的表达量也显著降低。纯化得到条带单一的Aa PGRP-LC蛋白。【结论】Aa PGRP-LC参与调控埃及伊蚊重要抗菌肽基因的转录,在埃及伊蚊响应细菌感染的过程中起到了重要的调控作用。Aa PGRP-LC在参与调控IMD通路的同时,也可能参与了Toll信号通路的调控过程。从原核表达系统中获得的Aa PGRP-LC重组蛋白可用于下一步的功能研究。     

斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白基因PGRP-LC1的克隆及功能分析

天生免疫系统是昆虫抵御外界病原入侵的主要方式。目前研究发现, Imd信号通路与按蚊感染柏氏疟原虫Plasmodium berghei的强度密切相关, 而PGRP-LC1是Imd信号通路最上游的受体之一。为了研究斯氏按蚊Anopheles stephensi肽聚糖识别蛋白PGRP-LC1, 采用RT-PCR并结合RACE技术克隆斯氏按蚊PGRP-LC1基因, 通过序列比较分析, 得到两条cDNA序列, 其开放阅读框分别为1 365 bp和1 290 bp, 3′非编码区为320 bp, 5′非编码区为240 bp。将两条cDNA分别命名为AsPGRP-LC1a（GenBank注册号 GU214232）和AsPGRP-LC1b（GenBank注册号GU214233）。AsPGRP-LC1a编码454个氨基酸, 分子量约为49.07 kDa;AsPGRP-LC1b编码429个氨基酸, 分子量约为46.3 kDa。AsPGRP-LC1b比AsPGRP-LC1a少一个长度为75 bp的外显子, 该外显子在冈比亚按蚊Anopheles gambiae PGRP-LC1基因的某些可变剪切形式中也有发现。分别将两个斯氏按蚊PGRP-LC1基因在冈比亚按蚊细胞系L3-5和斯氏按蚊细胞系MSQ43中过量表达, 通过双荧光素酶检测系统检测抗菌肽的表达情况, 结果显示克隆得到的PGRP-LC1基因在两种细胞系中均能够启动Imd信号通路, 为进一步研究斯氏按蚊的Imd信号通路提供了依据。     

鱼类肽聚糖识别蛋白的研究进展

肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是一类高度保守的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)家族,能够识别细菌细胞壁的主要成分肽聚糖,进而激活并调节机体的先天性免疫反应。目前已报道的鱼类PGRP共23种,根据氨基酸序列的不同,PGRPs主要分为3类,分别是短型、中型和长型PGRPs。尽管鱼类PGRPs在大小、结构域布局及亚细胞定位方面有一定差异,但其C端的PGRP结构域是高度保守的。鱼类PGRPs在不同组织中广泛表达,在不同细菌的刺激下,鱼类PGRPs在各免疫组织的表达量均明显改变,推测鱼类PGRPs参与了机体的免疫应答过程。此外,鱼类PGRPs在生理过程、胚胎发育的先天性免疫调节中也扮演了重要角色。目前有关鱼类PGRPs的功能研究主要集中在病原识别能力,酰胺酶活性、杀菌抑菌性和免疫调节机制四个方面,尽管已经取得了一定的进展,然而对其作用机制的研究还不够深入,未来需要进一步深入的研究。针对鱼类PGRPs的结构、表达及功能进行综述,旨在为今后深入研究鱼类PGRPs的功能及应用提供思路。     

光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白ApPGRP的表达与功能分析

【目的】旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力。【方法】构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)的结合能力。金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用S.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化。【结果】通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力。注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组。【结论】这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用。     

家蝇卵巢中保幼激素结合蛋白的研究(英语)

本文运用活性炭结合试验测定了家蝇卵巢中保幼激素结合蛋白(JHBP)的含量.卵巢中JHBP对JHⅢ有较高的结合活性,其结合常数为2.1×10~(-8)M,~3H保幼激素Ⅲ(~3H-JH)和JHBP的结合可被未标记的JH Ⅲ抑制,但保幼激素的类似物ZR 512或ZR515均无抑制效应.卵巢中JHBP的含量在家蝇羽化后48小时达最大值,是羽化后60小时、72小时家蝇卵巢中JHBP含量的6.5倍和15.5倍.羽化后24小时、36小时的家蝇卵巢无JHBP的结合活性.若刚羽化的家蝇用JHⅢ处理,36小时后,JHBP则可检测到.本实验的结果表明卵巢中JHBP浓度的变动可能和JH对家蝇卵黄发生的作用有关.     

革兰阴性菌结合蛋白(Toll/GNBPs)和肽聚糖识别蛋白(PGRPs)在无脊椎动物先天免疫应答中的作用

由于无脊椎动物没有专一的特异性免疫系统,所以先天免疫系统是其抵御外来病原入侵的唯一方式,无脊椎动物的先天免疫系统包括细胞和体液防卫机制,这2种机制可被模式识别受体(PRR s)分子所触发,PRR s可与微生物表面特异的物质识别并结合,通过结合,这些PRR s通过包囊和噬菌作用直接杀死微生物,或者通过丝氨酸蛋白酶级联反应和细胞内免疫信号途径间接引发不同的防御反应以抵御病原微生物。革兰阴性菌结合蛋白(GNBPs)和肽聚糖识别蛋白(PGRPs)作为无脊椎动物先天免疫系统中的一类重要模式识别受体,在识别微生物病原并引发一系列级联反应做出免疫应答过程中起重要作用。本文主要对GNBPs和PGRPs在无脊椎动物中的研究进展及其在先天免疫应答过程中的作用机制进行综述。     

三角帆蚌短型肽聚糖识别蛋白S3基因克隆及表达分析

肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是机体先天免疫系统中的重要模式识别受体,研究对三角帆蚌的一种短型肽聚糖识别蛋白进行了克隆与表达分析。研究采用5、3 RACE技术,对高通量转录组测序所得三角帆蚌PGRPS3基因（hcPGRPS3）片段分别进行了5,3末端克隆,经拼接得到hcPGRPS3 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcPGRPS3 cDNA全长序列进行了特征分析,实时荧光定量（qRT-PCR）检测了其组织分布,及经肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激后其在肝胰腺中的基因表达变化。hcPGRPS3 cDNA全长1438 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量大小为32.3 ku,pH 7.0时的理论等点为7.98。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明,其他物种短型PGRP中,以夏威夷短尾鱿PGRP4与hcPGRPS3同源性最高（51%）。qRT-PCR检测结果显示,hcPGRPS3在性腺及肝胰腺中表达水平较高。经PGN或LPS刺激后,肝胰腺中hcPGRPS3表达水平显著上调,表明hcPGRPS3可能在机体抗菌免疫反应中发挥重要作用。     

斜纹夜蛾视黄酸结合蛋白(Slcrabp)基因的克隆、表达及功能

视黄酸结合蛋白(Cellular retinoic acid binding protein,CRABP)属于胞内脂质结合蛋白超基因家族,参与了许多生理活动,如细胞分化、组织重建和信号转导等,但其在昆虫中肠的作用尚不明确。研究从斜纹夜蛾Spodoptera litura中肠基因表达序列标签(EST)文库中克隆获得一个编码Slcrabp的全长c DNA,该c DNA由396个核苷酸组成,编码132个氨基酸。预测CRABP蛋白质的空间结构与脂肪酸结合蛋白非常相似,含一个由10个反平行的β折叠和2个α螺旋形成的配体结合中心结构域。Sl CRABP基因具有4个外显子,与脊椎动物crabp基因类似。RT-PCR检测表明,在转录水平上,Slcrabp在6龄幼虫中肠的各个时期均有较高表达。Western blot分析结果显示,Sl CRABP蛋白分布广泛,在中肠、脂肪体、精巢等组织上大量表达。在中肠,其表达峰值出现在预蛹期。利用荧光标记物质8-苯胺基-1-萘磺酸(1,8-ANS)分析了重组Sl CRABP蛋白与不同底物的亲和力,发现Sl CRABP与不饱和长链脂肪酸有较高结合活性,如花生四烯酸钠、亚麻酸、油酸钠和油酸,但与视黄酸、视黄醇的结合力却很弱或几乎不结合,暗示斜纹夜蛾Sl CRABP功能与同家族脂肪酸结合蛋白(FABP)性质相似。对6龄幼虫进行饥饿处理,结果显示经过经24 h和48 h饥饿处理后,虫体中肠Sl CRABP蛋白质的表达量有显著上升,暗示Sl CRABP可能参与了斜纹夜蛾体内脂类的转运过程。     

非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白基因的克隆与鉴定

采用生物信息学方法首次对非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白(xePGRP-S)基因进行了克隆,并对其在胚胎发育和成年爪蟾各组织中的表达状况进行了分析。xePGRP-ScDNA全长720bp,开放阅读框为549bp,编码182个氨基酸。序列比对显示xePGRP-S与其他物种PGRP-S的序列相似性在42.4%-50.5%之间。RT-PCR显示在非洲爪蟾胚胎发育至3d时可以明显检测到xePGRP-S的表达,之后呈持续性表达,且在所检测的心、肝、脾、肺、肾、肠和胃这7种组织器官中呈组成型表达。       

家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测

金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。本研究根据EST序列信息,利用RACE技术克隆到1条家蝇Musca domestica金属硫蛋白基因MdMtn（GenBank登录号为GU289398）。序列分析表明,MdMtn cDNA全长408 bp,包含1个123 bp的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈-C-X-C-方式排列。此蛋白理论分子量为3.8 kD,等电点为878。为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了pET-DsbA-MT表达载体,并转化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行融合表达。研究发现MT重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示MdMtn基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。