S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗S2基因在体内变异分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121的S2基因在马体内的变异规律,本研究选用4匹成年马,其中2匹(#1、#2)接种EIAVDLV121,另外2匹作为对照.免疫后监测马体温、血小板含量以及病毒载量结果显示,免疫马未出现马传染性贫血体征.通过RT-PCR方法检测病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,结果显示,免疫马体内EIAVDLV121 S2蛋白的突变主要发生在氨基酸第17位、22位、39位、41位、51位和55位.另外,#1马免疫后70 d以及#2马免疫后第14 d和第28 d检测疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121亲缘关系较近,而#1马免疫后第42 d、第112 d和第140 d的疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121的致病性亲本强毒株EIAVDN40亲缘关系最近.本研究结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内感染进程的研究.     

感染性分子克隆衍生的马传染性贫血病毒的免疫学特性

将马传染性贫血病毒驴白细胞毒疫苗(DLA—EIAV)、DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)以及强弱毒嵌合毒(vOKVltr)分别接种健康马，并于接种后第220d，用EIAV强毒辽宁株(L-EIAV)攻击，观察临床变化，并测定接种后各结构蛋白的抗体变化。结果发现，攻毒后，2匹非免疫对照马和克隆衍生毒接种组中的1匹马体温均出现典型的稽留热并死亡，死亡马呈现典型的马传染性贫血的病理组织学变化，其他免疫马未见任何临床变化；在攻毒后第450d剖杀所有存活马，也未见任何病理组织学变化。抗体检测结果表明，免疫接种后攻毒前各组p11和p9抗体均检测不到，嵌合毒接种组p15、p26和gp45抗体水平高于其他组。攻毒后非免疫对照马体内抗p9、p11、p15、p26和gp45抗体均显著升高，并持续至死亡；嵌合病毒接种马体内各结构蛋白抗体水平与攻毒前没有显著变化，克隆衍生毒接种马体内各结构蛋白抗体水平比攻毒前有所升高。通过临床观察、病理组织学检测以及攻毒后各结构蛋白抗体记忆反应情况分析，置换了强毒LTR的DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒(强弱毒嵌合病毒)免疫马能够抵抗马传染性贫血病毒强毒的攻击，获得完全保护，而DLA—EIAV感染性分子克隆衍生毒免疫马未能完全抵抗强毒的攻击。     

中国株马传染性贫血病病毒S2基因的原核表达及其多克隆抗体制备

本实验为表达马传染性贫血病病毒(EIAV)S2蛋白和制备其抗血清,以EIAV感染性分子克隆pFDDV3-8为模板扩增S2基因,将其克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,将S2基因亚克隆于pET-30a表达载体,构建S2基因的重组表达质粒(pET-EIAV-S2),并转化DH5α受体菌.以终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导,表达的重组蛋白约20 ku.Western blot分析表明,该蛋白可与EIAV的阳性血清反应,具有免疫原性.该重组蛋白通过镍离子亲和层析进行纯化后,免疫新西兰兔.ELISA及western blot分析表明,制备的兔多克隆抗体与EIAV的S2蛋白发生特异性反应.EIAV S2蛋白的重组表达及其抗体的制备为进一步研究S2辅助蛋白在EIAV复制与致病中的作用,以及S2基因反向遗传研究奠定了基础.     

马传染性贫血病毒囊膜基因gp90 V4区糖基化回复突变感染性克隆的构建

为了阐明我国马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,本研究分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列.结果发现疫苗株在膜基因gp90 V4区潜在的N-连接糖基化位点出现了稳定的碱基替换,使该位点消失.为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLGFD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行了糖基化序列回复突变操作,构建了全基因感染性克隆pLGFDg9.将其转染驴胎皮肤细胞(FDD).通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性.结果表明,在FDD细胞中盲传3代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒.     

马传染性贫血病毒囊膜基因gp90V3区糖化回复突变感染性克隆的构建

为阐明我国马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,作者分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列。结果发现疫苗株在膜基因gp90V3区的潜在N-连接糖基化位点出现稳定的碱基替换,使该位点消失。为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLG—FD3—8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行糖基化序列回复操作,构建全基因感染性克隆pLGFDg5。将pLGFDg5转染驴胎皮肤细胞（FDD）,通过逆转录酶活性和RT-PCR方法评价其感染性。结果表明,将pLGFDg5在FDD细胞中盲传3代后,可在细胞培养上清中检测到逆转录酶活性,用RT—PCR检测到EIAV保守基因片段,在电镜下可见典型的EIAV粒子。在FDD细胞上的病毒复制动力学分析显示,与其亲本克隆pLGFD3—8的衍生病毒pLGFD3-V相比,回复突变克隆衍生的pLGFDg5-V复制速度较慢,获得较低的病毒载量。体外抗体中和试验表明,与其亲本pLGFD3-V相比,引入潜在的糖基化位点g5降低了衍生病毒对中和抗体的敏感性。这一结果为N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究提供了重要依据。     

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制.     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

马传染性贫血驴强毒gp90基因的克隆和序列分析

以EIAV驴强毒株D-AmRNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增了约1．4kb的gp90基因。将其克隆后进行了测序。测序结果表明所扩增的1338个核苷酸片段含有完整的gp90基因全序列。核苷酸和氨基酸序列比较分析结果表明：D-A EIAV与国内分离株辽系强毒L株差异率仅有1．8％，而与国外毒株(克隆1369，WENVl7、WENVl6、PSPEIAVl9)核苷酸差异率在35．5％～37．2％之间；D-A株与国内分离株L株氨基酸水平差异率在2．9％，而与国外毒株氨基酸水平上的差异率在42．6％—46．0％；D-AEIAV有19个N-连接糖基化位点，L株、WENVl7和WENVl6是18个，克隆1369、WENVl6和WENVl7亲本毒株PSPEIAVl9是12个。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。     

马传染性贫血病毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列变异

有研究认为病毒基因组长末端重复序列LTR与病毒的毒力和复制能力直接相关.中国马传染性贫血弱毒疫苗是由一株高致病力毒株经体外白细胞传代而致弱的疫苗.经过体外超过110代传代后,病毒丧失了对马高致死性毒力并保持了良好的免疫原性.本文对传代过程中的不同代次病毒基因LTR进行了克隆和序列测定,发现传代过程中LTR发生了一系列明确的变异,一是转录起始位点在64代之前均以GGAC为特征,64代之后则表现为不规律的GAAC,AAAC,AGAC或GGTC;二是TAR起始碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;三是在45代之后(55代除外),poly(A)附加位点一致表现为AA,这种一致的核苷酸变化均发生在毒力明显降低的代次,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系.     

通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAV_(FDDV12)体内复制的影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株跨膜蛋白主要免疫决定区基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码跨膜蛋白主要免疫决定区(TMIR)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的融合蛋白有一部分是可溶的，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中，重组的TMIR蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制、接种马体内免疫应答及马传贫诊断的研究。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因在真核细胞中的表达以及对宿主细胞增殖的影响

鸡传染性贫血是危害养禽业的重要疫病之一,其病原体是鸡传染性贫血病毒(CIAV)。该病原广泛存在于世界各地,是危害养禽业的主要病原。VP2是该病毒的重要非结构蛋白,其对宿主细胞的确切作用还不十分清楚。本文通过PCR从病毒DNA中扩增出VP2基因并将VP2基因亚克隆到真核表达载体pcDNA4.0。将重组质粒转染至BHK细胞,经Western-blotting证实,转染的真核细胞能表达VP2蛋白并具有良好的抗原性。pcDNA4.0-VP2转染293T或BHK细胞后,与对照组(空载体转染细胞以及未转染的细胞)相比,VP2超表达对这两种细胞的增殖没有影响。该结果表明鸡传染性贫血病毒的VP2基因不影响宿主细胞的增殖。     

马传染性贫血病毒自然感染马LTR序列分析

我国从20世纪70年代开始使用EIAV弱毒疫苗后,在全国范围内基本控制了马传贫的发生,我们从现地少数EIAV琼扩阳性马外周血中扩增并克隆了二株EIAV前病毒5'LTR序列,并与国内外毒株5'LTR序列进行了比较分析,发现中国EIAV LTR特有的特异性细胞转录因子结合基序,同时发现PEA2位点不是强毒特有的基序,在弱毒中亦发现该基序.