碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用,采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取P2代骨髓间充质干细胞,分为3组,正常培养组为对照组,其他2组分别转染重组腺病毒（Ad.bFGF-eGFP）及空病毒（Ad.eGFP）。相差显微镜观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞增殖曲线,ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型;碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组;ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化,增加增殖活力,促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。     

锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用体外培养骨髓间充质干细胞的生长及增殖

背景:如何简便有效的在体外大量扩增骨髓间充质干细胞,已成为神经科学研究热点.目的:观察锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对骨髓间充质干细胞体外生长及增殖的影响,以寻求体外快速、大量增殖骨髓间充质干细胞的有效方法.方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞.实验分为对照组(不加任何影响因子)、锌组、碱性成纤维细胞生长因子组、锌+碱性成纤维细胞生长因子组,分别用特定浓度的锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用.观察细胞生长曲线,用四唑盐比色法观察存活和增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,进行细胞表面抗原的鉴定.结果与结论:细胞生长曲线、四唑盐比色法、流式细胞仪结果均显示,第3～5天各组增殖能力达高峰,其中锌+碱性成纤维细胞生长因子组增殖能力最强(P<0.05).第7天,对照组及单独应用碱性成纤维细胞生长因子和锌组细胞增殖力均有所下降,仅锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞仍保持较强的增殖(P<0.05).锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中处于S+G2+M期的百分率最大,与其他3组相比差异有显著性意义(P<0.01).结果证实,锌和碱性成纤维因子均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用,联合应用锌和碱性成纤维细胞生长因子促增殖作用最强,可以作为体外扩增培养骨髓基质细胞的最佳培养条件.     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景:目前正在兴起的干细胞治疗技术及基因修饰技术有可能在肺动脉高压治疗中获得独特疗效。目的:探讨携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠血流动力学水平的影响。方法:选择3周龄SD雄性大鼠,于体外进行骨髓间充质干细胞培养及纯化,在腺病毒介导下实施基因转染,使碱性成纤维细胞生长因子基因成功导入骨髓间充质干细胞。将60只SD大鼠给予野百合碱腹腔注射(50 mg/kg)进行肺动脉高压模型复制,随机分成3组,其中肺动脉高压组于颈内静脉移植1 m L的L-DMEM培养基,骨髓间充质干细胞组于颈内静脉移植1 m L空腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞悬液,碱性成纤维细胞生长因子组于颈内静脉移植1 m L腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞悬液。结果与结论:经3周治疗后,各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P>0.05);其中碱性成纤维细胞生长因子组大鼠的肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05);各组大鼠右心室的肥大指数比较差异无显著性意义(P>0.05);碱性成纤维细胞生长因子组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果显示携带碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞移植,能够改善肺动脉高压大鼠肺血管的血流动力学水平,保护机体血管的内皮细胞,并拮抗血管的收缩。     

Pluronic F-127负载骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子修复兔膝关节软骨缺损

目的探讨应用Pluronic F-127负载骨髓间充质干细胞（MSCs）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法抽取青紫蓝兔骨髓,行MSCs原代及传代培养,将3代MSCs作为种子细胞。将32只青紫蓝兔造成双膝关节4 mm×4 mm关节软骨缺损模型,随机分为四组,实验组缺损内植入负载了MSCs和bFGF的Plu-ronic F-127;细胞组植入负载了MSCs的Pluronic F-127;生长因子组植入负载了bFGF的Pluronic F-127;对照组缺损不做处理。于术后4周和16周,处死动物取材,进行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色,且对各组修复组织行组织学评分及比较。结果术后4周时实验组与其他三组比较修复效果不明显;术后16周,大体观察及HE染色示实验组缺损已不易辨认,以透明样软骨修复为主,Pluronic F-127基本降解仅残余少量颗粒,甲苯胺蓝染色示细胞周围基质有较多异染质,而细胞组和生长因子组缺损表面不平整,界限清晰,修复组织以纤维组织为主,仅周缘见少许纤维软骨出现,对照组仅缺损底部有纤维组织覆盖。根据Wakitani评分标准术后16周时实验组的修复效果明显好于其他三组。结论 Plu-ronic F-127结合MSCs和bFGF的复合物最终形成类关节软骨样组织,基本修复关节软骨缺损,此方法简便易行,有实用价值,有望成为临床治疗软骨缺损的一种新方法。     

壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子载体诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的探索壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)载体对骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法免疫组织化学、Western blot检测MSCs诱导分化为神经细胞,MTT检测诱导后细胞的活性。结果 MSCs经壳聚糖-bFGF载体诱导后,表达神经干细胞的标记物Nestin以及神经细胞的标记物β-tubulinⅢ和MAP-2,比例高达83.54%。结论壳聚糖-bF-GF载体可以诱导MSCs高比例向神经细胞分化。     

血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞

背景：骨髓间充质干细胞植入机体不同类型组织后可以分化为相应组织的靶细胞，提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向，但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚。目的：检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—03／2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者，无血液系统疾病和家族遗传病史。血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品。方法：无菌条件下取健康人骨髓，采用Ficoll密度梯度离心＋贴壁法分离纯化培养骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞，诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10％胎牛血清的DMEM培养液，对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液，置37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化，免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达，透射电镜观察细胞超微结构。结果：诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形，呈内皮样细胞形态特征，CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达，细胞胞浆内可见W-P小体。对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性。结论：血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞。     

人骨髓间充质干细胞生长特性及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的:观察人骨髓间充质干细胞的生长特性及表面标记,探讨碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响。方法:实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室、苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。①骨髓组织均取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者,年龄10～16岁,全部在患者家属的同意下,于后方髂嵴骨髓穿刺,一次性采集骨髓20mL。Percoll梯度离心,附壁筛选人骨髓间充质干细胞进行原代培养。②原代接种后48h换液,待贴壁细胞即将铺满瓶底时用胰酶消化分离,按3×103/cm2密度接种于6孔培养板,记为P1;传代培养过程中贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养板的底面时,再重复以上操作,记为P2,以此类推,传代培养直至细胞出现衰老征相。③取第2代间充质干细胞,消化后计数2×105细胞与抗CD34,CD44抗体室温反应30min,流式细胞仪分析细胞表型。④将生长良好的第2代人骨髓间充质干细胞以500个/孔种植在96孔培养板中,加入完全培养液的同时,再加入碱性成纤维细胞生长因子,使其成为浓度分别为0,1,5,10,25,50,100μg/L的条件培养基,每个浓度重复5孔。培养2d后,于各小孔内加入5g/L噻唑蓝20μL,继续培养4h后每孔加入二甲基亚砜200μL,用酶标仪在492nm波长下检测人骨髓间充质干细胞增殖情况。⑤实验分组同上,各培养孔加入TritonX-100100μL,4℃过夜,每孔加入碱性磷酸酶底物液150μL,酶联免疫监测仪测定410nm波长下人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性。结果:①人骨髓间充质干细胞原代和传代培养的生长曲线分析:原代接种后5～9d为细胞生长潜伏期,11～16d为对数增殖期,18～20d为生长平台期。传代培养细胞生长潜伏期为12～24h,对数增殖期为7～10d,11～13d进入细胞生长平台期。②人骨髓间充质干细胞的表型:人骨髓间充质干细胞均一表达CD44,不表达CD45。③碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响:与空白对照比较,较低浓度的10μg/L碱性成纤维细胞生长因子即可显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(t=2.852,P<0.05),且与其浓度成正性量效关系。25～100μg/L碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性均可产生显著抑制作用(t=3.248,P均<0.05)。结论:人骨髓间充质干细胞可在体外迅速扩增,碱性成纤维细胞生长因子对其增殖作用与浓度成正性剂量-效应关系。     

心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞自体移植的影响

目的：了解骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在心肌梗死的缺血心肌微环境中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性，及同时心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对此过程的影响。方法：将21只兔结扎左前降支制作急性心肌梗死模型，骨穿抽取骨髓，分离培养扩增MSCs。随机分成3组，术后2周进行心肌梗死瘢痕内移植5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine，BrdU)标记的MSCs(加或不加bFGF)(MSCs组、MSCs+bFGF组)，对照组注射培养基。心肌梗死手术前、手术后3d及移植后4周做超声心动图检测心功能，处死动物取左室标本作冷冻切片，采用免疫荧光法鉴定植入细胞，并检测VIII因子相关抗原以测量毛细血管密度。结果：两细胞移植组左室切片中均可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞。对照组未见BrdU染色阳性细胞。VIII因子阳性内皮细胞计数表明MSCs组及MSCs+bFGF组毛细血管密度分别为每高倍视野29&;#177;8和31&;#177;6，显著高于对照组(21&;#177;5)(F=11．971，P&;lt;0．01)，超声心动图检测证实MSCs组及MSCs+bFGF组移植后4周射血分数显著大于对照组(F=5．850，P&;lt;0．05)，两细胞移植组间上述各项差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：缺血心肌内注射MSCs可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗死心肌，促进血管新生从而改善心功能，可用于心肌梗死的治疗；心肌内单次直接注射bFGF对MSCs自体移植无显著影响。     

诱导人骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化过程中肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景:骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓内的非造血干细胞,因其具有自我更新能力及多向分化潜能,且分离培养方法成熟,在组织器官修复及再生方面显示出良好的应用前景,将为终末期肝病的治疗如生物人工肝及肝细胞移植提供新的细胞来源,但目前人骨髓间充质干细胞向肝系细胞诱导分化培养体系尚不成熟。目的:观察肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝系细胞分化的可能性。设计:开放性实验。单位:南昌大学第一附属医院传染科与泌尿外科研究所。材料:实验于2004-07/2005-03在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。所用骨髓由成年健康志愿者提供(均对本实验知情同意)。DMEM/F12培养基(Gibco公司);表皮细胞生长因子,肝细胞生长因子,胰岛素,转铁蛋白,鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体,FITC-兔抗鼠IgG(Sig-ma公司);碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen公司);鼠抗人角蛋白18,19单克隆抗体(Chemicon公司);胎牛血清(杭州四季青)。方法:以骨髓腔穿刺方式抽取成年健康志愿者髂后上棘处骨髓10mL,采用密度梯度离心法分离和反复贴壁法纯化骨髓间充质干细胞。取培养至4～8代细胞,消化后以107L-1接种到放置20mm×20mm爬片的预先铺被有0.1%明胶的24孔板中,次日换液,改用无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的表皮细胞生长因子和10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子)培养2d后,换成无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的肝细胞生长因子,10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,5mg/L的胰岛素,5mg/L的转铁蛋白)进行诱导分化,每3d换液1次,以未加入肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞作为对照组。骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,放射免疫荧光法测甲胎蛋白浓度。诱导当天及第7,14,21,28天,取诱导细胞爬片,细胞免疫荧光法检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、角蛋白18和角蛋白19的表达,并进行糖原染色检测诱导细胞的糖原合成情况。主要观察指标:①细胞形态学观察。②培养上清液中甲胎蛋白表达量的测定。③肝细胞表面标志检测结果。④诱导细胞的糖原合成情况。结果:①诱导第14天可观察到细胞变成短梭形和多角形,随培养时间的延长多角形细胞增多,并可形成肝细胞样的细胞集落。②诱导第14天培养上清液内可检测到甲胎蛋白的分泌,每孔浓度为0.1μg/L;第17天达高峰0.4μg/L;第21天下降至0.3μg/L。③诱导第14天甲胎蛋白、角蛋白18表达呈阳性,第28天角蛋白19表达呈阳性。④诱导第21天糖原染色呈阳性反应。结论:肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能够诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝细胞分化,表达肝细胞特异性表面标志,并具有合成糖原、分泌甲胎蛋白的功能。     

碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对恒河猴骨髓源性神经干细胞的体外诱导增殖作用

目的:探索骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)体外诱导分化为神经干细胞(nervestemcells,NSCs)的增殖条件,比较碱性成纤维细胞生长因子(basefibroblastgrowthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对神经干细胞生长曲线的影响,为BMSCs在神经科学领域内的应用提供参考。方法:以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,实验组利用NSC培养基和bFGF,EGF生长因子,进行体外培养、诱导、增殖。对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖。Nestin及CD133作为免疫细胞化学鉴定NSCs的细胞标志。结果:原代培养第6天时多数细胞表现为Nestin及CD133抗原阳性,此后实验组及对照组细胞数量开始明显扩增,但实验组增殖更为明显,bFGF+EGF组从第8天时的(96.30±8.78)×104增加到第18天时的(1407.90±26.62)×104,并且增殖开始的时间较对照组提前2d。NSCs在10d后有少量细胞向神经元和神经胶质细胞分化。结论:bFGF与EGF联合应用能够促使NSCs增殖时间提前及增殖效能显著提高。另外,bFGF和EGF还具有诱导NSC向神经细胞分化的作用。     

转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面生长状况

背景:颌面骨缺损是临床上常遇到的问题,寻找理想的种子细胞同支架材料复合构建组织工程化人工骨成为该类疾病治疗的发展趋势.目的:将转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞与珊瑚骨的复合培养,观察转染碱性成纤维生长因子基凶的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况.设计、时间及单位:骨组织工程实验,于2006-0312008-06 在中山大学口腔医学研究所完成.材料:选用海南省浅海滩产石头状滨珊瑚为原料,将其制成8mm×8mm×2mm的珊瑚人工骨小块.方法:采用密度梯度离心法分离新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,采用贴壁筛选法对分离出的骨髓间充质下细胞进行纯化,利用脂质体转染bFGF-pcDNA3到骨髓间充质干细胞.取生长良好的转染碱性成纤维生长因子基因骨髓间充质干细胞和未转染的骨髓间充质干细胞,分别接种于不同珊瑚表面.主要观察指标:MTT法观察细胞-支架联合培养骨髓间充质干细胞的增殖情况和利用扫描电镜观察珊瑚支架上细胞的生长状况.结果:MTT法检测显示细胞-支架联合培养转染组细胞与联合培养未转染组细胞增殖相比差异有显著性意义(P＜0.05),联合培养转染组细胞生长增殖强于未转染组细胞.而联合培养的转染组细胞同单纯培养转染组细胞增殖相比差异无显著性意义(P＞0.05).扫描电镜观察显示复合骨髓间充质干细胞细胞贴附在珊瑚上,并在材料上完全铺展,形态多样,细胞向孔内长入或跨越微孔表面,部分区域有细胞外基质形成.结论:转染碱性成纤维生长因子基因的骨髓间充质干细胞在珊瑚支架材料上生长状况较未转染组好,珊瑚人工骨不影响骨髓间充质干细胞的增殖,可以作为骨髓间充质干细胞支架材料构建组织工程骨.     

经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体内分化的影响

背景：体外研究显示,碱性成纤维细胞生长因子能促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。然而,在体内环境下经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能否促进骨髓间充质干细胞分化尚不明确。目的：探讨经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞在体内分化的影响。方法：①杂种犬12只,采用密度梯度离心与贴壁培养法在体外分离、培养骨髓间充质干细胞,增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞并分析转染率。②开胸结扎法建立急性心肌梗死模型,1周后将存活犬（n=10）随机分为骨髓间充质干细胞组（n=5）和碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组（n=5）,采用OTW球囊经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子和增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞。移植后1周,免疫荧光法比较两组梗死心肌内增强型绿色荧光蛋白阳性细胞共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白I的数量。结果与结论：增强型绿色荧光蛋白慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,转染率达85%;灌注后免疫荧光显示,23.5%的切片可以看到增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞阳性细胞;碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组增强型绿色荧光蛋白共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白 I 的细胞数量明显高于骨髓间充质干细胞组（P＆lt;0.05）。因此,经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能更有效地促进骨髓间充质干细胞分化成血管内皮细胞和心肌细胞;采用该途径联合灌注碱性成纤维细胞生长因子和骨髓间充质干细胞有望发挥协同作用,更好地促进心脏修复。     

心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞自体移植的影响

目的:了解骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在心肌梗死的缺血心肌微环境中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性,及同时心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对此过程的影响。方法:将21只兔结扎左前降支制作急性心肌梗死模型,骨穿抽取骨髓,分离培养扩增MSCs。随机分成3组,术后2周进行心肌梗死瘢痕内移植5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的MSCs(加或不加bFGF)(MSCs组、MSCs+bFGF组),对照组注射培养基。心肌梗死手术前、手术后3d及移植后4周做超声心动图检测心功能,处死动物取左室标本作冷冻切片,采用免疫荧光法鉴定植入细胞,并检测VIII因子相关抗原以测量毛细血管密度。结果:两细胞移植组左室切片中均可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞。对照组未见BrdU染色阳性细胞。VIII因子阳性内皮细胞计数表明MSCs组及MSCs+bFGF组毛细血管密度分别为每高倍视野29±8和31±6,显著高于对照组(21±5)(F=11.971,P<0.01),超声心动图检测证实MSCs组及MSCs+bFGF组移植后4周射血分数显著大于对照组(F=5.850,P<0.05),两细胞移植组间上述各项差异无显著性意义(P>0.05)。结论:缺血心肌内注射MSCs可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗死心肌,促进血管新生从而改善心功能,可     

人骨髓间充质干多细胞生长特性及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的观察人骨髓间充质干细胞的生长特性及表面标记,探讨碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响.方法实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室、苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.①骨髓组织均取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者,年龄10～16岁,全部在患者家属的同意下,于后方髂嵴骨髓穿刺,一次性采集骨髓20 mL.Percoll梯度离心,附壁筛选人骨髓间充质干细胞进行原代培养.②原代接种后48 h换液,待贴壁细胞即将铺满瓶底时用胰酶消化分离,按3×103/cm2密度接种于6孔培养板,记为P1;传代培养过程中贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养板的底面时,再重复以上操作,记为P2,以此类推,传代培养直至细胞出现衰老征相.③取第2代间充质干细胞,消化后计数2×105细胞与抗CD34,CD44抗体室温反应30 min,流式细胞仪分析细胞表型.④将生长良好的第2代人骨髓间充质干细胞以500个/孔种植在96孔培养板中,加入完全培养液的同时,再加入碱性成纤维细胞生长因子,使其成为浓度分别为0,1,5,10,25,50,100μg/L的条件培养基,每个浓度重复5孔.培养2 d后,于各小孔内加入5 g/L噻唑蓝20μL,继续培养4 h后每孔加入二甲基亚砜200μL,用酶标仪在492 nm波长下检测人骨髓间充质干细胞增殖情况.⑤实验分组同上,各培养孔加入Triton X-100 100μL,4 ℃过夜,每孔加入碱性磷酸酶底物液150μL,酶联免疫监测仪测定410nm波长下人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性.结果①人骨髓间充质干细胞原代和传代培养的生长曲线分析原代接种后5～9 d为细胞生长潜伏期,11～16 d为对数增殖期,18～20 d为生长平台期.传代培养细胞生长潜伏期为12～24 h,对数增殖期为7～10 d,11～13 d进入细胞生长平台期.②人骨髓间充质干细胞的表型人骨髓间充质干细胞均一表达CD44,不表达CD45.③碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响与空白对照比较,较低浓度的10μg/L碱性成纤维细胞生长因子即可显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(t=2.852,P＜0.05),且与其浓度成正性量效关系.25～100μg/L碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性均可产生显著抑制作用(t=3.248,P均＜0.05).结论人骨髓间充质干细胞可在体外迅速扩增,碱性成纤维细胞生长因子对其增殖作用与浓度成正性剂量-效应关系.     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响

背景:肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的一员,因其生物活性的多效性而备受关注.目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-04/07在沈阳医学院完成.材料:健康雄性Wister大鼠5只,由沈阳医学院实验动物中心提供.碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品.方法:无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.取第2代肌源性干细胞,分别用终浓度为6.25,12.50,25.00,50.00,100.00μg/L碱性成纤维细胞生长因子进行干预;以单纯加入200 μL生长培养基作为空白对照组,以加入200μL生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组.分别于培养24,48,72,96 h加入MTT溶液.主要观察指标:免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况.结果:肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应,少数呈Desmin阳性反应.①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞的促增殖效应:与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P<0.05);浓度为6.25-50.00 μg/L时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P<0.01),至50.00 μg/L时其促增殖作用接近顶峰.②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应:随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P<0.01)的时间为培养96 h.结论:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度一时间依赖性增加,50.00 μg/L与96 h为较佳的体外培养质量浓度和时间.