神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

脐带间充质干细胞分离、鉴定与神经分化

目的原代分离培养脐带间充质干细胞（UCMSCs），并就其向神经细胞方向分化潜能予以研究，为脑创伤后神经组织再生修复提供理论依据。方法采用原代贴壁培养法分离培养人UCMSCs，取第4代UCMSCs进行流式细胞术检测UCMSCs表面特异标志物表达；经神经诱导后应用细胞免疫荧光技术检测神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达和神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白（MAP-2）表达。结果流式细胞术结果显示UCMSCs强表达CD29、CD44、CD105，极低表达CD31、CD34、CD45，检测结果符合人UCMSCs特征。细胞免疫荧光结果显示UCMSCs经诱导后GFAP阳性表达率为56．23％，NSE阳性表达率为22．15％，MAP-2阳性表达率为27．34％。结论采用原代细胞贴壁培养法可成功分离培养人UCMSCs，在适当诱导条件下，UCMSCs可实现向神经细胞方向的成功分化，为脑创伤后神经组织修复、再生提供可能。     

骨髓源性神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的探索骨髓基质细胞(BMSCs)诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件和发生机制,比较不同血清浓度、不同白介素-1(IL-1α)及不同胶质细胞源神经营养因子(GDNF)浓度及不同组合浓度等诱导条件下BMSCs分化情况;为BMSCs在神经科学领域内的应用奠定基础。方法以成年SD大鼠BMSCs为实验对象,利用IL-1α、胶质细胞系来源GDNF等作为增殖及分化诱导因子,进行增殖培养、分化诱导;免疫细胞法进行细胞性质鉴定。结果加入GDNF、IL-1 α增殖培养诱导6 d,部分细胞有神经巢蛋白成分表达;三周测出 DA受体D2检测阳性,GDNF IL-1α组与 GDNF组及IL—1α组比较分化率更加显著(P<0．05)。结论 BMSCs在体外培养条件下,联合GDNF 和IL-1α诱导分化并配合使用高浓度血清(10％)可获得神经巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元;骨髓源性神经干细胞可以诱导分化为多巴胺能神经元。     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

胶质细胞源性神经营养因子诱导骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化的观察

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在体外能否诱导骨髓基质细胞（BMSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化及可能机制。方法无菌条件下，抽取成年SD大鼠胫骨内骨髓组织，分离制备成单细胞悬液进行培养。将增殖传代至第5代的BMSCs随机分为GDNF诱导组和对照组。继续培养7d后，应用BrdU／GFAP、BrdU/NeuN和TH免疫荧光单标和双标技术检测BMSCs增殖和分化情况。结果两组BMSCs继续培养7d后，增殖仍然活跃，有部分细胞向神经元和胶质样细胞分化，呈Brdu，GFAP、BrdU/NeuN和TH阳性表达，但GDNF组的增殖力更强，向神经元和TH神经元分化的数量明显多于对照组（P〈0．05）。结论GDNF能促进BMSCs的增殖和诱导BMSCs分化成神经元和胶质样细胞，其中少部分可分化为TH神经元（即DA能神经元）。     

慢病毒介导的EphrinB2基因转染大鼠骨髓间充质干细胞表达的实验研究

目的将携带Ephrin B2基因慢病毒转染至骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其过表达水平及细胞形态学变化,并探讨Eph B4/Ephrin B2是否具有促进大鼠BMSCs体外迁移活性的作用。方法单纯贴壁法分离大鼠BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长形态。携带Ephrin B2慢病毒以感染复数3和10感染BMSCs分为低浓度转染组(MOI=3)和高浓度转染组(MOI=10),对照组采用未转染组、阴性转染组,利用q PCR检测Ephrin B2基因表达及Western blot检测Ephrin B2蛋白水平。观察Ephrin B2基因转染后BMSCs形态学变化。15 d后通过免疫荧光检测MAP2表达了解细胞分化。进一步Transwell实验检测细胞迁移能力来了解Eph B4/Ephrin B2在调节干细胞迁移的作用。结果培养BMSCs为多角形或棱形呈漩涡状排列生长。Ephrin B2-BMSCs经q PCR和Western blot检测证实有外源性Ephrin B2表达。Ephrin B2基因转染后BMSCs 24 h,BMSCs胞体开始收缩细胞有突起伸出,72 h后可见典型的神经样细胞形态改变。15 d后,BMSCs分化成为MAP2神经元,与阴性转染组相比,低浓度转染组和高浓度转染组MAP2表达率上升(P0.05)。Transwell实验结果显示:低浓度转染组与高浓度转染组较未转染组及阴性转染组穿膜细胞数量明显增加(P0.05)。结论慢病毒介导Ephrin B2能高效感染BMSCs,并随着时间延长分化成神经样细胞,同时Eph B4/Ephrin B2在调节BMSCs迁移具有重要作用。     

成人骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞实验研究

目的探讨骨髓基质细胞的体外培养、扩增及诱导其向神经元样细胞定向分化的方法。方法采用改进的全骨髓培养法,培养来源于正常成人献髓者的骨髓基质细胞。传至第5代,用全反式维甲酸(RA)等细胞因子诱导分化,于诱导后第7d和第14d行神经元细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(β-tublin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定,计数诱导前后的细胞。结果成人骨髓基质细胞经RA 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 脑源性神经营养因子(BDNF)诱导后可见神经元样细胞出现,经NSE、MAP-2及β-tublin免疫组化和荧光鉴定阳性,NSE表达率达到48.5%±0.2%。结论骨髓基质细胞在体外扩增迅速,纯化需时短,并可在全反式维甲酸等细胞因子诱导下向神经元样细胞分化。     

恒河猴骨髓基质细胞向成熟神经细胞分化的实验研究

目的研究恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)在体外向神经细胞诱导分化过程中神经递质分泌和神经细胞抗原表型表达情况。方法无菌条件下密度梯度法分离猴BMSCs,在体外应用神经干细胞培养液进行体外培养和诱导分化,分阶段用高效液相色谱法检测培养基中单胺类生物活性物质的含量,免疫细胞化学方法检测神经细胞抗原表型。结果高效液相检测神经干细胞培养基未测到单胺类生物活性物质,而经体外培养增殖10d、14d、30d的细胞培养基可检测到去甲肾上腺素 (NE)和多巴胺(DA)。Asp方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,培养基中所含的NE和DA尤显著性差异(P>0．05)。同期细胞免疫组化检测出酪氨酸羟化酶(TH)、巢蛋白抗体(nestin)、β-微管蛋白 (β-tublin)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFALP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论恒河猴BMSCs能在体外增殖,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并合成、分泌NE和DA;部分细胞表达神经干细胞、成熟神经元、胶质细胞和DA能神经元的抗原表型,提示在一定条件下,诱导分化的 BMSCs经过神经干细胞阶段可向成熟神经组织细胞分化。     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。 目的：验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。 方法：对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为2组：实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组。3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色。将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架，分为4组培养：复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组，1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组，且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示，Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架；模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组。结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖，有利于细胞之间的信号传递，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境；作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原。     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

神经生长因子、Noggin基因转染对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究外源性神经生长因子(NGF]、Noggin转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性,并观察基因修饰的细胞向神经元方向的分化情况.方法 采用贴壁法分离纯化BMSCs,通过细胞表面标志及成脂诱导鉴定细胞.Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs.通过Westernblot、免疫细胞化学观察目的 蛋白表达.通过免疫组化观察转染后BMSCs向神经元方向分化情况.结果贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型,能分化为脂肪细胞.未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin.NGF、Noggin单独及联合转染BMSCs均能高效表达目的 蛋白.NGF、Noggin转染的BMSCs可分化为具有神经元形态,并表达神经丝蛋白(NF-H)的细胞,联合转染组NF-H阳性细胞比例最高.结论 贴壁法能有效纯化BMSCs,Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin单独及联合转染BMSCs安全并能高效表达目的 蛋白,NGF、Noggin转染的BMSCs 体外培养能向神经元样细胞方向分化,两种蛋白联合修饰能增强这种分化作用.     

骨髓间充质干细胞治疗血管性痴呆大鼠行为学及海马CaM、CaMK Ⅱ表达水平的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs)侧脑室移植治疗血管性痴呆(vascular dementia,VaD)模型对大鼠行为学及海马钙调蛋白(calmodulin,CaM)、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)表达的影响。方法以全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs);流式细胞仪对所培养BMSCs进行表面抗原鉴定;成纤维生长因子(basic fibroblast growth factorbfic,b FGF)和丁羟基茴香醚(beta hydroxy acid,BHA)诱导BMSCs分化为神经元细胞,并对诱导后的细胞,进行神经元特异性的免疫组化鉴定;采用改良四血管法制备Va D模型,设立对照组,造模4 w后将VaD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、BMSCs治疗组。观察4 w后实验大鼠的行为学表现及应用Real-time PCR检测海马CaM、CaMKⅡ表达水平。结果 BMSCs治疗组行为学表现有明显改善。其海马CaM、CaMKⅡmRNA表达比模型组降低(P<0.05)。结论侧脑室移植BMSCs显著改善VaD大鼠行为学表现,并使其海马CaM、CaMKⅡ表达降低。     

大鼠骨髓间质多潜能成年祖细胞体外培养和神经分化潜能的研究

目的:探讨大鼠骨髓间质中多潜能成年祖细胞(muhipotent adult progenitoi-cells or MAPCs)的体外培养与神经分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:采用Ficoll-Paque液(1.077g/L)和免疫微磁珠从大鼠双侧股骨和胫骨骨髓中分离与纯化出多潜能成年祖细胞,体外扩增,分别采用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维生长因子-8(FGF-8)等试剂的无血清L-DMEM诱导MAPC分化为神经元。应用免疫荧光化学技术和RT-PCR等方法对分化细胞进行鉴定。结果:多潜能成年祖细胞在休外扩增可超过50代,细胞形态和神经分化能力没有发生变化。在碱性成纤维生长因子的诱导下,MAPC形态转变为典型的神经样细胞,神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。继续用BDNF、FGF-8持续诱导,MAPC可分化为更加成熟的神经样细胞,微管相关蛋白-2(MAP-2)表达阳性;RT-PCR显示诱导出的神经样细胞,酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺β-羟化酶(DBH)mRNA表达水平明显升高。结论:建立了多潜能成年祖细胞体外分离、培养的条件,探索了多潜能成年祖细胞部分生物学特性,多潜能成年祖细胞在体外可以持续增殖并可诱导分化为较成熟的神经元样细胞,它可为多潜能成年祖细胞的临床应用提供材料。     

兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的动态观察体外神经营养剂联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的效果.方法将BMSCs分离体外扩增培养后,分别加入神经营养剂金路捷、三磷酸腺苷(ATP)、神经节苷脂(GM1) bFGF诱导其分化.分别于6、24、48、72、96h后光镜下观察细胞形态变化并通过免疫组织化学测定特异性神经元稀醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果神经营养剂联合bFGF诱导6 h后出现胞体收缩,Nestin表达阳性,24 h后伸出突起,有不同程度NSE、GFAP表达,3 d后达高峰.结论神经营养剂联合bFGF能提高诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导率.     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样 细胞的分化：与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较*☆

背景：目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能。 目的：探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性。 方法：将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组：条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM。各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达。与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异。结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高。     

神经节苷脂诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的作用的研究

目的探讨神经节苷脂(GM1)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经细胞的作用。方法通过贴壁法分离大鼠BMSCs,体外扩增3代,加入GM1诱导分化。用倒置显微镜观察诱导分化后BMSCs的形态,免疫组化染色检测其神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。逆转录PCR检测BMSCs神经生长因子(NGF)mRNA和脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达水平,并与胎牛血清(FBS)对照组和空白对照组的BMSCs比较。结果GM1诱导组BMSCs胞体变圆,突起增加,部分突起相互联结成网状,NSE阳性表达细胞为(29.47%±3.26)%,GFAP阳性表达细胞为(2.32±0.18)%,FBS组和空白对照组分别为(6.97±0.56)%和(10.6±0.75)%的细胞NSE表达阳性,(1.41±0.35)%和(1.21±0.35)%的细胞GFAP表达阳性。GM1诱导组NGFmRNA和BDNFmRNA水平显著高于FBS对照组(均P<0.01)和空白对照组(均P<0.05)。结论GM1在体外能诱导BMSCs分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化潜能的体内外研究

目的 体内外研究大鼠骨髓间充质于细胞向神经细胞分化的潜能.方法 从大鼠骨髓中分离培养得到的BMSCs传至5代后分为A组,无诱导剂组;B组,神经细胞诱导组;C组,成骨诱导组;D组,脂肪细胞诱导组.流式细胞仪检测细胞的免疫表型.A,B两组行神经细胞相关蛋白检测;C组行茜素红染色,D组行油红O染色.将Hoechst3258标记的第5代BMSCs立体定向植入(n=10只)大鼠顶叶皮质,4周后观测.结果 BMSCs表面CD29、CD44、CD90阳性,CD31、CD34、CD45阴性.在体外,A组细胞仅Nestin阳性,B组细胞Nestin、MAP2、NSE、GFAP均呈阳性,且形态类似神经细胞.C组经诱导后可见矿化结节.D组细胞浆内出现脂肪滴.大鼠脑内移植部位可见Hoechst3258染色阳性的BMSCs.并呈Nestin,MAP2、NSE、GFAP阳性.结论 体外BMSCs易于分离、培养及扩增.BMSCs具有多向分化潜能,可通过诱导向脂肪、成骨及神经细胞分化.在体外能自发表达神经干细胞相关蛋白,在大鼠脑内可自发向神经细胞分化.     

底蜕膜间充质干细胞分化为多巴胺能样神经元

目的 探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞体外向多巴胺能样神经元分化的潜能,并优化诱导方案.方法 体外分离培养底蜕膜间充质干细胞,用表皮生长因子(EGF)+人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+ B27添加剂和人音猬因子(SHH)+成纤维细胞生长因子8(FGF8)+forskolin+脑源性神经营养因子(BDNF)分两个阶段对其进行诱导;免疫细胞化学先后检测干细胞标记nestin和CD133、成熟神经元标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质细胞标记胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶(TH)的表达;Western blot验证诱导后TH蛋白的表达;高效液相色谱-电化学检测诱导前后多巴胺的分泌.结果 经第一阶段诱导后,细胞形成漂浮生长的神经球,nestin和CD133均呈阳性表达;第二阶段诱导后,出现明显的神经元样形态,NSE、GFAP和TH均阳性表达,Western blot也显示TH蛋白的表达,多巴胺分泌量相比诱导前明显增加(P＜0.001).结论 底蜕膜间充质干细胞体外可分化为多巴胺能样神经元,可能成为帕金森病干细胞移植治疗新的种子细胞来源.     

黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对

背景：实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例。但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚。 目的：分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟。 设计、时间及地点：细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成。 材料：取孕14 d SD大鼠,用以分离培养神经干细胞。 方法：利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养。用含有10 μmol/L黄芩苷的培养基作用7 d,并设置空白对照组。以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞。 主要观察指标：应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子 mRNA表达的影响。 结果：与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例（P < 0.05）。与星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷对β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无明显影响（P > 0.05）。与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例（P < 0.01）。黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48 h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）;作用72 h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）。 结论：黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关。     

骨髓基质细胞分化为神经元样细胞后与皮质神经元间突触的建立

目的 观察与大脑皮质神经元共培养的骨髓基质细胞(BMSCs)经诱导分化成神经元样细胞后,与脑皮质神经元之间形成功能性突触的情况.方法 无菌条件下取绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓,用贴壁筛选法体外培养获得GFP转基因小鼠BMSCs(GFP-GM-BMSCs),在体外培养、扩增、纯化.取第3代GFP-GM-BMSCs,种植到源于小鼠大脑的原代皮质神经元和胶质细胞中,培养介质为加有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基(Neurobasal-A+2%B27),体外模拟建立细胞移植的共培养体系.共培养第10天,利用FM1-43荧光染料染色活动突触小泡的特性,通过荧光显微镜观察共培养的两种细胞之间形成的突触.结果 与神经元共培养的GFP-GM-BMSCs在含有EGF、bFGF的无血清培养基中7 d后分化为神经元样细胞.共培养10 d后,FM1-43染色阳性的突触囊泡明显增加,主要位于神经元样细胞胞体、突起及其末端结构上.结论 在体外模拟细胞移植共培养体系中,分化自GFP-GM-BMSCs的神经元样细胞能与神经元之间形成突触样连接.