干酪乳酪杆菌Zhang在酸和低温胁迫下“活的非可培养”态的诱导研究

为探究干酪乳酪杆菌Zhang(Lacticaseibacillus casei Zhang)在酸和低温胁迫下能否形成活的非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态。该实验将L.casei Zhang置于不同pH值(2.5、3、4、5、6)的MRS液体培养基中，在4℃条件下进行酸和低温胁迫，不同时间点取样，然后采用平板计数法、荧光显微镜和流式细胞术3种方法对胁迫后的菌体进行活性测定。实验结果显示，低温条件下L.casei Zhang在pH值为2.5、3、5、6胁迫下未获得VBNC态；L.casei Zhang在pH 4的MRS液体培养基低温胁迫120 d获得了VBNC态，革兰氏染色观察到VBNC态细胞长度变短变弯曲。该研究为L.casei Zhang VBNC态的机理研究提供了一定的参考依据。     

应用拉曼光谱对比分析德式乳杆菌保加利亚亚种ND02及其VBNC态细胞成分

采用扫描电子显微镜、单细胞拉曼光谱技术对比分析德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ND02）正常及其非可培养态（viable but non-culturable，VBNC）细胞的表观形态和细胞内部大分子化合物的变化。扫描电子显微镜结果显示，与正常细胞相比，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02的VBNC态细胞变短、变粗，且细胞表面发生褶皱；VBNC态细胞的拉曼光谱与正常细胞差异显著，主要集中在1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm－1等处的12 个峰，主要反映细胞内蛋白质、核酸等生物大分子变化，结果表明德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02在诱导进入VBNC态时可能通过调整核酸、脂类和蛋白质适应不利环境的影响；研究结果也证实拉曼光谱技术可以在单细胞水平上对德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02及其VBNC态细胞内大分子物质进行无损、无标记检测分析。     

干酪乳杆菌Zhang在不同温度下的膜脂肪酸变化分析

探究了干酪乳杆菌Zhang在不同温度下细胞膜脂肪酸变化。将干酪乳杆菌Zhang在MRS培养基中培养的对数生长末期菌体分别置于37、45、60、70℃4种温度水浴锅中进行热处理，不同时间点取样，采用Bligh&Dyer法提取脂肪酸后通过气相色谱仪测定其组分，并分析含量变化。结果显示，干酪乳杆菌Zhang在不同温度处理下，主要有5种脂肪酸发生了变化；从相对百分含量上看，细胞中不饱和脂肪酸增加，饱和脂肪酸减少。推测干酪乳杆菌Zhang通过调节脂肪酸的组分和含量改变细胞膜流动性来维持其生存能力，这为初步解析干酪乳杆菌Zhang逆境生存机理提供了数据参考。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02活的非可培养态诱导和复苏

为有效提高乳酸菌发酵剂菌种在生产和应用过程中的活性,对一株具有优良发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02(保加利亚乳杆菌ND02)进行了活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)态诱导和复苏的初步研究。将活化的保加利亚乳杆菌ND02在不同复合条件下进行诱导,同时采用平板计数法和荧光显微镜两种计数方法对其进行检测,将诱导成功的样本通过改变温度及改变培养基成分进行复苏实验。结果表明:保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导190 d便可以进入VBNC态,并发现10%脱脂乳+0.1%酵母粉是有效的复苏方法。为保加利亚乳杆菌ND02在应用过程中避免VBNC态的产生及活性的提高提供一定的参考依据。     

干酪乳杆菌Zhang在模拟人工胃液下膜脂肪酸的变化分析

微生物为应对不利于其生长的环境变化,细胞膜脂肪酸组分和含量等细胞内部成分均会发生改变。为了探究干酪乳杆菌Zhang在模拟人工胃液下细胞膜脂肪酸变化,将干酪乳杆菌Zhang对数生长末期的菌体分别置于pH为2.5、3、3.5的人工胃液中处理,不同时间点取样,提取脂肪酸后通过气相色谱法测定其组分和含量。结果显示,在模拟人工胃液下,干酪乳杆菌Zhang有主要的7种脂肪酸发生了变化,从相对百分含量上看,细胞中不饱和脂肪酸增加,饱和脂肪酸减少。推测干酪乳杆菌Zhang通过调节脂肪酸的种类和含量改变细胞膜流动性来维持其生存能力,这为初步解析干酪乳杆菌Zhang逆境生存机理奠定了基础。     

干酪乳杆菌Zhang在逆境条件下基因表达的差异分析

为了探讨益生菌干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下转录水平上的基因表达差异。本文选取干酪乳杆菌Zhang中与糖代谢、氨基酸代谢、细胞膜脂肪酸以及应激蛋白等相关的12个主要基因为研究对象,将干酪乳杆菌Zhang用MRS液体培养基活化3代后置于4℃条件下进行逆境胁迫,间断性取样,采用反转录PCR对选定基因的表达水平进行动态监测。结果表明,干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下,3个糖代谢相关基因(苹果酸乳酸酶基因、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)、1个细胞膜脂肪酸相关基因(环丙烷脂肪酸合成酶基因)、1个应激蛋白相关基因(分子伴侣Gro EL基因)共5个基因表达上调;而DNA引发复制酶基因、3个氨基酸代谢相关基因(阳离子转运酶基因、D-谷氨酸代谢基因、ABC转运体ATP结合蛋白基因)、2个细胞膜脂肪酸基因(磷脂合成基因、短链醇脱氢酶基因)、磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白基因等7个基因表达下降。这为解析干酪乳杆菌Zhang在胁迫条件下的生理、生化特性的改变及其抗性机制提供了参考依据。     

益生菌Lactobacillus casei Zhang与商业益生菌对胃肠转运耐受性及发酵特性的比较

比较益生菌干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)与商业化益生菌嗜酸乳杆菌NCFM(NCFM)、鼠李糖乳杆菌GG(LGG)、干酪乳杆菌Shirota(kS)、动物双歧杆菌Bb12(Bb12)对人工胃肠液的耐受性及发酵特性.将各菌置于人工消化液及含3.0g/L牛胆盐的MRS培养基中,37℃培养,分别于3h和8h时测定人工胃液和肠液中各菌株的存活率,同时每小时测定MRS培养基的浊度,以延迟时间评价各菌株对胆盐的耐受性.对由各菌株制得的发酵乳在发酵及贮藏期间酸度与活菌数的变化进行了测定,结果表明,在pH 2.5的人工胃液消化3 h后,干酪乳杆菌Zhang存活率低于NCFM(p<0.05),高于其它3株对照菌(p<0.05);在pH 3.0和pH 4.0的人工胃液消化3 h后,干酪乳杆菌Zhang的存活率与4株对照菌无显著差异(p>0.05);在pH 8.0的人工肠液消化8h后,干酪乳杆菌Zhang的存活率高于Bb12(p<0.05),低于NCFM(P<0.05),与其它2株对照菌元差异(p>0.05).干酪乳杆菌Zhang对3.0g/L牛胆盐的耐受性与LcS差异不显著(p>0.05),而高于其它3株对照菌(p<0.05).脱脂乳37℃发酵24 h后,接种干酪乳杆菌Zhang的样品的酸度低于4株对照菌.4℃贮藏28 d内,各益生菌在发酵乳中继续生长,其中干酪乳杆菌Zhang发酵乳的pH值变化(降低0.55)显著高于4株对照菌(p<0.05);贮藏28 d后干酪乳杆菌Zhang活菌数为1.0×109 cfu/g,显著高于4株对照菌(p<0.05),说明干酪乳杆菌Zhang具有良好的胃肠转运耐受性和极佳的贮藏稳定性.     

乳及乳制品中常见“活的非可培养态”食源致病菌研究进展

细菌在环境胁迫下能够进入一种“活的非可培养态”（viable but nonculturable state,VBNC）,常规的平板培养方法无法检测出该种状态细菌,但其仍具有可测量的代谢活性,能够在适合的条件下复苏并产生毒力。乳及乳制品因其含有丰富的营养物质而成为理想的细菌培养基,其中几种常见的食源致病菌如副溶血性弧菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌等也被证实能够进入VBNC,对乳及乳制品品质安全造成严重威胁。因此,本文综述了VBNC细菌的研究进程和细胞形态、毒力等生理学特性,并介绍了乳及乳制品中几种常见VBNC致病菌的诱导与复苏因素及其检测方法。通过对VBNC细菌的综述进而为乳及乳制品中致病菌研究提供新思路,以期减少乳及乳制品中该状态致病菌对公共安全的威胁,提升乳及乳制品中生物性安全水平。     

益生菌干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9发酵乳胞外多糖含量对流变学特性、质构和稳定性的影响

干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9是我国自主开发具有良好益生特性的益生菌,发酵乳是益生菌的最优载体之一。本研究以2株益生菌应用于发酵乳为研究对象,采用多频扩散波谱法研究发酵过程中的流变学特性,通过稠度、硬度、内聚性和黏度指数测定分析发酵乳的质构特性,并分析贮藏期间活菌数和稳定性,胞外多糖(EPS)含量。结果表明,干酪乳杆菌Zhang、乳双歧杆菌V9和二者复配的发酵乳中EPS含量从贮藏期起始的(546.3±31.5),(361.1±20.1),(515.2±17.5)mg/L至贮藏期末增至(1 165.4±37.8),(903.6±33.9),(1 103.8±45.6)mg/L,显著高于对照组(P0.05)。在发酵过程中,干酪乳杆菌Zhang组表现出较高弹性因子和低固液平衡值的流变学特性,显示形成紧密的凝胶结构。后熟后,干酪乳杆菌Zhang(包括单一和复配)发酵乳的稠度、硬度、内聚性和黏度指数显著较高,乳双歧杆菌V9发酵乳硬度和黏度指数显著较高,前者的黏度和持水性显著高于对照组,后者的黏度显著高于对照组(P0.05)。各组发酵乳贮藏期间的后酸化程度没有显著差异(P0.05),表明益生菌及其代谢产生的EPS对发酵乳流变学特性、质构特性及贮藏稳定性具有积极影响,且干酪乳杆菌Zhang作用较为突出。此外,干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9在贮藏期间活菌数在10~8CFU/mL以上,可有效保证益生菌发挥其促进健康的作用。综上,在发酵乳中添加益生菌干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9,不仅能够赋予发酵乳益生功效,而且能够改善质构特性和贮藏稳定性。本研究为实际生产、推广应用提供技术依据,同时为益生菌发酵乳的发酵及贮藏特性评价提供研究思路和方法。     

干酪乳杆菌Zhang分类学地位及潜在益生相关基因分析

干酪乳杆菌Zhang是本研究团队筛选出的具有优良特性的益生乳酸菌菌株。传统方法难以区分干酪乳杆菌及其近缘物种。因最近乳杆菌的系统分类进行了更新，故导致Zhang的分类地位需重新确认。本研究利用比较基因组学方法分析Zhang的分类学地位、耐药基因、致病性基因和环境抗性基因特征，探究该菌株基因组上携带的细菌素基因簇和潜在益生基因。比较基因组学结果显示Zhang与副干酪乳酪杆菌模式菌株ATCC 25302T的平均核苷酸一致性值是98.49%，通过分类学数据库比对和系统发育分析确认Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌。Zhang的基因组不含有耐药基因、致病性基因和环境抗性基因。在其基因组上注释到核心肽、LanT转运和引导切割及免疫或运输功能等Carnocin细菌素基因簇。此外，Zhang的基因组编码了谷胱甘肽合成、核黄素合成、黏附因子和分泌胞外多糖等潜在益生基因。本研究更新了Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌，揭示其不含有耐药基因、致病性基因及环境抗性基因，并注释到多个潜在益生基因，为该菌株进一步开发及产业化提供了数据参考。     

不同发酵剂对半硬质干酪品质影响研究

利用筛选的一种单一菌株(乳酸乳球菌)和两种混合菌株(乳酸乳球菌干酪乳杆菌(1:1)、瑞士乳杆菌:干酪乳杆菌(1:1))制作发酵剂,然后用于加工半硬质干酪,通过测定成熟干酪的性能指标,研究它们对干酪品质的影响.结果表明,瑞士乳杆菌:干酪乳杆菌(1:1)制作的干酪感官评定值最高,且与另外两种菌株制作的干酪差异显著;结合其他性能指标,确定适于半硬质干酪加工的最佳发酵剂菌株为瑞士乳杆菌:干酪乳杆菌(1:1).     

乳酸菌影响腌制芥菜亚硝酸盐含量的通径分析

目的 探索一种优质、安全的芥菜腌制方法。方法 采用3因素3水平的正交试验方法,研究了接种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(L. plantarum)和干酪乳杆菌(L. casei)对腌制芥菜品质和亚硝酸盐含量的影响。结果 影响腌制芥菜亚硝酸盐和感官指标的主要因素均为短乳杆菌,影响腌制芥菜总酸、氨基态氮含量的主要因素分别为植物乳杆菌和干酪乳杆菌。本试验的最佳工艺组合为,鲜芥菜接种15 mL/kg短乳杆菌+20 mL/kg干酪乳杆菌,腌制芥菜的氨基态氮含量(12.7 mg/kg)比对照高10.4%,亚硝酸盐含量(0.46mg/kg)比对照降低60.3%。结论 短乳杆菌是影响腌制芥菜亚硝酸盐含量的决策因子;干酪乳杆菌构成了影响腌制芥菜亚硝酸盐含量波动的限制因子,主要通过氨基态氮对亚硝酸盐含量产生较大的间接正向作用。     

庆大霉素适应性菌株遗传稳定性研究

适应性进化是工业微生物遗传育种的重要技术手段之一。以庆大霉素连续进化1 200代的干酪乳杆菌Zhang为研究对象,将其在去掉选择压力的培养基中连续传1 000代,对其细胞形态、活菌数、浊度、耐药表型、基因型的变化进行跟踪监测。研究结果显示:适应性菌株在去掉选择压力环境中进化1 000代后,其细胞形态、活菌数、浊度及耐药表型趋于稳定;基因组仅检测到11个突变位点,包括4个同义突变位点和7个非同义突变位点。干酪乳杆菌Zhang庆大霉素适应性菌株具有良好的遗传稳定性。     

基于气质联用技术的唾液乳杆菌渗胁迫响应代谢组学研究

采用气质联用技术分析了高渗胁迫下唾液乳杆菌胞内代谢物变化,结果表明:不同细胞代谢模式下,氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类、胺类和糖类及其衍生物等具有显著差异,这些代谢物直接参与了细胞渗透胁迫响应相关的主要生化反应和关键代谢通路。     

VBNC状态啤酒易感乳杆菌的诱导及复苏

本文研究了一种典型的难培养啤酒易感乳杆菌-耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)形成"活的但不可培养"(VBNC)的诱导方式,以及从此状态复苏至可培养状态的方法。将培养至对数期的耐酸乳杆菌2011-11菌株采用啤酒内连续传代驯化法还原其在啤酒酿造过程中的实际生存状况,并通过荧光染料染色对诱导后的耐酸乳杆菌细胞进行活性检测;利用逐步升温和添加促进物法对VBNC菌进行复苏试验。当连续传代至第19代,MRS检测平板上可培养菌数降为零,此时菌体多数仍存在呈现绿色荧光的活细胞,表明耐酸乳杆菌已形成VBNC状态,且仍具有污染啤酒能力;将刚进入VBNC状态的耐酸乳杆菌菌悬液经过氧化氢酶处理后涂布于MRS平板,于26℃厌氧培养,可使耐酸乳杆菌复苏至可培养状态。本研究证实,可通过啤酒内连续传代诱导获得VBNC状态耐酸乳杆菌,而添加过氧化氢酶改良常规MRS平板是一种有效的复苏方法。     

瑞士乳杆菌H11发酵乳饮料的ACE抑制活性及代谢组学研究

目的:研究瑞士乳杆菌H11与副干酪乳杆菌Lc-01两种发酵乳饮料在贮藏期间的代谢差异变化。方法:使用气相色谱-质谱（SPME-GC-MS）联用、高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF MS）技术对4 ℃、贮藏28 d期间发酵乳饮料中的挥发性风味物质、代谢物以及ACE抑制活性之间的差异进行分析。结果:在4 ℃贮藏28 d后,瑞士乳杆菌H11发酵乳饮料的体外ACE抑制活性比副干酪乳杆菌Lc-01高60%以上,ACE抑制肽VPP和IPP含量也显著高于Lc-01（P<0.05）。采用SPME-GC-MS发现瑞士乳杆菌H11发酵乳饮料中香气成分丰富,特征风味物质2-庚酮和2-壬酮相对含量较高,分别为43.84%和12.39%。基于UPLC/Q-TOF MS的结果表明,贮藏期间两种发酵乳饮料的主要代谢差异物为肽、氨基酸和有机酸。结论:瑞士乳杆菌H11在制备发酵乳饮料方面存在巨大潜力。     

热辅助超声波处理中VBNC态鼠伤寒沙门氏菌产生及其机制

为了研究热辅助超声波(TS)处理中鼠伤寒沙门氏菌进入活的非可培养态(VBNC)的情况及可能机制,本文采用RT-qPCR与平板计数法检测其VBNC态发生情况,采用ESR方法定性、定量检测TS处理中产生自由基并用数学模型分析其与VBNC态发生率指数之间的关系。结果表明:TS处理强度与VBNC态鼠伤寒沙门氏菌产生及自由基强度有重要影响。经TS处理,在BPY培养基中主要产生3种自由基,包括以碳为中心自由基、羟基自由基与氢质子自由基。自由基强度与VBNC态发生率指数之间高度相关,可用Boltzmann模型进行拟合和验证。以丙酮酸钠作为自由基清除剂,验证了自由基对鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC态具有重要作用。本研究结果对于TS处理技术的应用具有指导意义。     

瑞士乳杆菌对契达干酪成熟期间品质的影响

干酪的成熟是形成干酪特有的组织状态、质地和风味的关键工序。将分离自内蒙古传统乳制品中的瑞士乳杆菌SMN2-1作为非发酵性乳酸菌添加到契达干酪的生产中,通过检测其成熟过程中理化指标、气味变化和质构特性等指标,分析了瑞士乳杆菌对契达干酪成熟的影响。结果显示:在90 d的成熟期内,两组干酪的蛋白质、脂肪、水分和盐分含量之间差异不显著(p>0.05),但添加瑞士乳杆菌SMN2-1的干酪成熟第90 d的气味明显改变,内聚性、弹性和咀嚼性等物性指标均高于对照,因此添加瑞士乳杆菌SMN2-1可以有效促进蛋白质分解和干酪的成熟,同时改善干酪的风味和质地。     

特异性检测干酪乳杆菌的引物探针设计

目的：基于肠杆菌科基因间重复共有序列聚合酶链反应（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR）技术,设计特异性引物探针,实现干酪乳杆菌的靶向检测。方法：以干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HP-B1142为研究对象,通过不同实验,优化干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的ERICPCR反应体系。通过凝胶电泳获得特定的条带,对其进行测序和分析,设计出特异性的引物探针,达到对干酪乳杆菌靶向鉴别的目的。结果：通过不同实验,得到干酪乳杆菌的最佳ERIC-PCR反应体系;基于干酪乳杆菌ERIC基因片段,获得两对特异性引物,可在多种DNA的混合溶液中快速靶向鉴别出干酪乳杆菌。结论：基于ERIC-PCR技术获得的特异性引物探针,可高效、灵敏地实现复杂生境中干酪乳杆菌检出。     

益生菌咀嚼片硬度与益生菌细胞存活率的关系

对4种不同硬度的益生菌咀嚼片中的干酪乳杆菌(L.casei Zhang)和长双歧杆菌B1(Bifidobacterium Longum B1)进行活菌检测,并测量相应片剂的厚度和长度。结果表明,40、60、80、100N硬度片剂中L.casei Zhang存活率分别为65.3%、56.6%、51.8%、39.0%;长双歧杆菌B1存活率分别为58.0%、47.5%、31.0%、12.0%。片剂中L.casei Zhang耐受压片机压力的能力高于长双歧杆菌B1。活菌检测时片剂研磨成粉末会损失一部分活菌。片剂厚度、长度与片硬度呈负相关。