大菱鲆家系选育二代7种免疫因子的分析

为选育高成活率的大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)群体,对30个大菱鲆选育二代家系(F2)和1个普通养殖群体进行鳗弧菌攻毒实验(周期为14 d),统计分析死亡率。选取死亡率不同的6个选育家系和普通养殖群体构成7个实验组,采用半定量-聚合酶链反应(semi-quantitative polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术对它们肝脏、脾脏、头肾的相关免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(Ig M)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表达量开展研究,并应用SPSS 16.0软件对攻毒前后各免疫因子的表达量与攻毒后存活率之间的相关性进行分析。研究结果表明:攻毒前后选育家系幼鱼肝脏、脾脏、头肾中7个免疫因子的表达量普遍高于普通养殖幼鱼,且在7个实验组中,攻毒后的表达量相较攻毒前均呈现下降趋势;攻毒前,肝脏中lysozyme、Ig M的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01),HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表达量与存活率为显著性正相关(P0.05);脾脏中,Hepcidin、HSP70和HSP90的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01);头肾中,HSP70的表达量与存活率为显著正相关(P0.05)。综上,可以推断选育家系相对于普通养殖群体大菱鲆抗鳗弧菌性能更强,且7种免疫因子在鳗弧菌感染鱼体的过程中发挥重要的抗感染作用;从F2中获得一个抗鳗弧菌性能较强的家系(23号),可用于今后大菱鲆抗鳗弧菌品系的选育指导工作,为大菱鲆高成活率群体的选育提供参考资料和理论依据。     

基于核酸适配体的差减荧光法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鳗鲡、虹鳟和大菱鲆等多种水产动物,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的前提和基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体之间有较强的亲和特异性,首次建立了一种基于核酸适配体的可定量检测鳗弧菌的差减荧光法。该方法对鳗弧菌有较好的特异性,对鳗弧菌的检测荧光值是其他菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌)的4～11倍,对鳗弧菌的最低检测限为10²CFU/mL,可用于10²～10⁸CFU/mL的范围内的定量检测。通过对不同盐度海水和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果表明,回收率和相对标准偏差等指标均符合相应的标准,说明该检测方法可用于海水样品和水产动物组织中鳗弧菌的检测。     

低盐在短时间内对绿潮浒苔(Ulva prolifera)氮磷吸收的动态影响

我国黄海出现的绿潮发源于黄海南部苏北辐射沙洲紫菜养殖区,苏北沙洲区濒临的沿岸河网众多,来自沿岸径流的淡水携带大量氮磷等营养盐间歇性入海,导致海水的富营养化并伴随着盐度的周期性波动。本研究通过模拟实验研究低盐度(15和5)对浒苔吸收氮盐(NO_3~–-N和NH_4~+-N)和磷盐(PO_4~(3–)-P)的影响,主要发现:与盐度30相比,在低盐度(15和5)时,浒苔对NO_3~–-N的1h最大吸收速率(V_(max))和亲和力(V_(max)/Ks)分别提高280%和350%左右,半饱和常数(Ks)下降15%左右,并能够维持对NO_3~–-N的高效吸收(24h);盐度15和5时,浒苔对NH_4~+-N的1h最大吸收速率(V_(max))分别提高40%和200%,亲和力(V_(max)/Ks)分别提高20%和180%, Ks分别提高15%和30%,但是盐度降低对NH_4~+-N的长效吸收产生负面影响,甚至在盐度5条件下出现吸收高浓度NH_4~+-N后再释放的现象;与盐度30相似,盐度15条件下浒苔能够快速吸收PO_4~(3–)-P,而盐度5则导致藻细胞内的PO_4~(3–)-P在早期阶段快速流失,并在后期不能有效吸收PO_4~(3–)-P。本实验的结果表明,降低盐度有利于浒苔对氮源的快速吸收,在盐度15下浒苔能够实现对硝酸盐和磷盐的高效吸收。     

鳗弧菌感染对斑节对虾免疫相关指标的影响

为了研究鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对斑节对虾(Penaeus monodon)免疫相关指标的影响,分别对斑节对虾注射生理盐水和鳗弧菌,测定了不同时间点肝胰腺和鳃中总抗氧化能力(T-AOC)、溶菌酶(LSZ)和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)活性以及一氧化氮(NO)含量的变化。结果显示,与对照组相比,感染鳗弧菌后,肝胰腺和鳃中T-AOC活性分别于6和12 h达到最大值(P0.05),随后逐渐降低;肝胰腺和鳃中LSZ活性分别于6和12 h升高至最大值,随后均于24 h显著低于对照组(P0.05);肝胰腺和鳃中NO含量分别于6和3 h达到最大值,随后肝胰腺中NO含量于24 h降低至最小值,而鳃中NO含量于6和24 h虽有降低,但仍显著高于对照组;肝胰腺中i NOS对感染反应较为敏感,活性于3 h达到最大值,而鳃中i NOS活性于6 h开始显著上升,并于12 h达到最大值(P0.05)。研究表明,长时间的鳗弧菌感染对斑节对虾免疫相关指标有显著影响;T-AOC、LSZ、NO和i NOS对鳗弧菌感染均反应敏感,可以作为弧菌病诱发的监测指标。     

养殖水体中氨氮对大菱鲆的急性毒性效应研究

为了评估大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐氨氮性状的遗传参数和为循环水养殖大菱鲆提供科学指导,作者研究了养殖海水中氨氮对4月龄和8月龄大菱鲆的急性毒性效应,同时对比了氨氮对白化和正常个体、雌性和雄性个体的急性毒性效应差别。结果表明:非离子氨对4月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为2.19、1.94、1.80、1.72 mg/L,对8月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为3.64、3.02、2.93、2.86 mg/L,非离子氨对4月龄和8月龄大菱鲆的安全质量浓度分别为0.17和0.29 mg/L;氨氮对白化和正常大菱鲆以及雌性和雄性大菱鲆的急性毒性效应均没有显著性差异,研究结果为进一步选育大菱鲆的耐氨氮品系提供科学依据。     

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对青蛤(Cyclina sinensis)的毒性及半致死浓度研究

利用不同浓度的鳗弧菌对青蛤进行了急性毒性实验,观察青蛤在菌液胁迫下的存活情况,进一步统计得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度。结果表明,青蛤在鳗弧菌液浓度OD600为1.0—2.2范围内,胁迫96h以内死亡率呈逐渐上升趋势,并且在OD600=2.2时所有受试个体全部死亡。在相同的胁迫时间内,受试个体死亡率与胁迫浓度均呈正相关。经SPSS16.0软件分析后,最终得到鳗弧菌对青蛤的半致死浓度(LC50)为OD600=1.57,说明鳗弧菌对青蛤有明显的毒害作用。     

Influence of combined changes in salinity and copper modulation on growth and copper uptake in the tropical green macroalga Ulva reticulata

The influence of salinity on growth and Cu uptake in the green macroalga Ulva reticulata collected from the intertidal area in the Western Indian Ocean was studied under controlled laboratory conditions. Exposure concentrations ranged from 5 to 500 μg Cu l⁻¹ at five salinities (ranging 20–40). The accumulation of Cu increased with decreasing salinity, so that the uptake at 500 μg Cu l⁻¹ was approximately 2.7, 2.4 and 2.0 times higher at salinities of 20, 25, and 30 respectively, than uptake at salinity of 35, and with uptake being lowest at salinity of 40. Ulva maintained a positive growth rate over the whole salinity range (20–40), with highest rates at salinity of 35. When exposing to Cu at low salinities (20 and 25), the growth rate of Ulva was strongly inhibited suggesting an increase in toxicity of Cu with decreasing salinity. EC50 and NOEC increased with increase in salinity, implying a reduced Cu toxicity at high salinities. It was concluded that salinity needs to be considered when using macroalgae, such as U. reticulata, as a bioindicator of heavy metals in areas with heavy rainfall, underground fresh water intrusion or in estuaries, as they might accumulate more metals and be more negatively affected.     

小球藻对不同盐度海水养殖尾水的净化效果研究

微藻处理养殖尾水已成为热点研究方向,有关一定盐度范围内海水养殖尾水的微藻处理研究较少。本试验调配了两种盐度(16和26)的海水养殖尾水,以空白组作对照,设置小球藻(Chlorella salina)初始接种密度梯度(5×10⁵、1×10⁶、2×10⁶和3×10⁶个/mL),研究小球藻对海水养殖尾水中不同形态氮和磷的去除效果。结果表明,小球藻在海水养殖尾水中生长良好,可有效去除尾水中的氮磷营养盐,16盐度组中各初始藻密度组对NH₄⁺、NO₃^-和总溶解态氮(total dissolved nitrogen,TDN)的去除率分别为85.03%~85.87%、60.87%~63.70%和54.53%~57.64%,组间无显著差异(P>0.05);26盐度组中除5×10⁵组外,其余藻密度组对NH₄⁺、NO₃^-和TDN的去除率分别为87.23%~88.16%、56.70%~57.79%和53.31%~54.62%,且组间无显著差异(P>0.05),表明小球藻初始接种密度对尾水中氮盐的去除无显著影响。除5×10⁵个/mL组外,16与26盐度组中对TDN的去除率无显著差异,表明盐度变化对氮的去除无影响。随着初始藻密度的升高,16和26处理组对总溶解态磷(total dissolved phosphorus,TDP)的去除率均上升,分别为76.13%~99.53%和63.72%~96.83%,表明藻初始接种密度的升高可促进尾水中磷的去除,且盐度升高没有影响小球藻对磷的去除。本研究获得了不同初始接种密度小球藻对一定盐度范围的海水养殖尾水的吸收利用特点,可为海水养殖尾水的生态化处理提供一定的理论基础。     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

海马齿对不同盐度水质的碳汇作用以及不同形态氮利用的研究

为探讨海马齿(Sesuvium portulacastrum)对水域环境修复作用,本文研究了水培海马齿对不同盐度水质的碳汇作用以及不同形态氮的利用情况。实验设计0、10、20、30、35盐度梯度,海马齿水培时间82 d,然后测定植株干重、营养元素含量以及积累速率,最后在抑菌与不抑菌条件下研究海马齿根际与铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)、无机磷(PO₄^3-)以及色氨酸(Trp)吸收转化关系。研究结果表明,盐度10条件下海马齿植株干重、有机元素含量以及积累速率最高,有机碳、有机氮与有机磷积累速率分别为(5.572±1.611)、(0.313±0.058)、(0.057±0.013)mg/(d·ind.),而高盐环境35盐度条件下对海马齿生长造成一定胁迫。盐度0～35范围,海马齿均未出现死亡现象。不同盐度抑菌培养条件下,色氨酸与无机氮共存时均能被能被海马齿利用,色氨酸利用量远高于硝态氮、铵态氮;不抑菌条件下铵态氮则表现出增加的结果。海马齿作用在盐度...     

矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧菌的鉴定

2009年8月江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼（砂nechogobius hasta）大量死亡．从病鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对虾虎鱼的半数致死量（LD,0）为1．63×10^6cfu／g。对分离菌进行了形态特征、理化特性和分子生物学等方面的分析。一方面．分离...     

盐度对菲律宾蛤仔摄食率和清滤率的影响

实验室条件下,对15、20、25、30和35五个盐度梯度下菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的摄食率RI和清滤率RC进行了测定。结果表明,在15~25的盐度条件下,蛤仔的摄食率RI和清滤率RC随着盐度的升高而增大,在25时达到最大值,而在25~35盐度条件下,随盐度的增加而减小。     

Spectrophotometric pH measurement in estuaries using thymol blue and m-cresol purple

The conditional acid dissociation constants (pK_a′) of two sulfonephthalein dyes, thymol blue (TB) and m-cresol purple (mCP), were assessed throughout the estuarine salinity range (0<S<40) using a tris/tris–HCl buffer and spectrophotometric measurement. The salinity dependence of the pK_a′ of both dyes was fitted to the equations (25 °C, total proton pH scale, mol kg soln⁻¹):

The estimated accuracy of pH measurements using these calculated pK_a′ values is considered to be comparable to that possible with careful use of a glass electrode (±0.01 pH unit) but spectrophotometric measurements in an estuary have the significant advantage that it is not necessary to calibrate an electrode at different salinities. pH was measured in an estuary over a tidal cycle with a precision of ±0.0005 pH unit at high (S>30) salinity, and ±0.002 pH unit at low (S<5) salinity. The pH increased rapidly in the lower salinity ranges (0<S<15) but less rapidly at higher salinities.     

The effect of salinity on clearance rate in the suspension-feeding estuarine gastropod Crepipatella dilatata under natural and controlled conditions

The suspension-feeding gastropod Crepipatella dilatata occurs in estuaries in southern Chile that experience considerable fluctuations in salinity, driven by tidal and atmospheric forces. In the Quempillén estuary salinities as low as 9 psu may occur after severe rainstorms, and persist for several hours. In this study salinity was the major factor influencing the clearance rate of C. dilatata. At salinities below 20 psu, filtration ceased, whereas at high salinities (>22 psu) mean clearance rate was 0.24 l h⁻¹ standard animal⁻¹ (S.D. 0.18) for actively filtering individuals. This was confirmed by laboratory experiments under controlled conditions. Endoscopic observations were consistent with measurements of clearance rate, and showed that at salinity 25–30 psu the rate of transport along the gill filaments of particulate material embedded in mucus was 759 μm s⁻¹ (S.D. 480), but particle transport ceased at and below salinity 20 psu. Complete or partial isolation of the mantle cavity from the environment may be a mechanism to protect soft tissues and/or incubated egg capsules from osmotic stress.     

养殖鲟鱼出血症病原鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是鲑鳟鱼类和温水性鱼类肠炎红嘴病的主要病原,可引起病鱼体表出血、肠道肿胀发炎等临床症状。本研究从患出血症施氏鲟(Acipenser schrenckii)中分离到一株致病性菌株(YR-H01),生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析表明YR-H01株为鲁氏耶尔森菌。人工感染该菌后发病鱼表现为肛门红肿、外突明显,部分鱼鳍基部和下颌处有出血现象,内脏器官不同程度出血,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对施氏鲟的半致死浓度为7.2×106CFU,且攻毒剂量越大,临床病症出现越快。病理组织切片显示,该菌感染鲟鱼后肝细胞发生明显病变,淋巴细胞侵润,肝索结构消失,细胞肿胀,核空泡变性或核仁边缘化。     

Effect of low salinity on the survival of recently hatched veliger of Nassarius reticulatus (L.) in estuarine habitats: A case study of Ria de Aveiro

The effect of low salinity on the survival of recently hatched veliger of the gastropod Nassarius reticulatus (L.) was studied under laboratory conditions at 17 °C ± 1 °C. Significant mortality occurred for salinities ≤ 17 psu and the LS₅₀ (salinity that causes 50% mortality) varied from 14.5 psu to 17.2 psu for exposures between 1 h and 48 h, respectively. The results were included in a mathematical model in order to estimate the mortality of N. reticulatus veliger in Ria de Aveiro under different salinity scenarios determined by numerical simulation. The model predicts a massive mortality of veliger immediately after their eclosion (1 h) in Ria de Aveiro during spring tide when the river input reaches its expected maximum — a situation that has been observed occasionally and may overlap a massive eclosion of veliger in the water. Except in this extreme situation, the mortality in Ria de Aveiro is generally restricted to the upstream limits of the channels. The results indicate that N. reticulatus recruitment in estuaries may strongly depend on the prevailing salinity regime.     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)性状的微卫星分子标记研究

采用微卫星分子标记技术分析验证了133对微卫星分子标记,以期为大菱鲆(Scophthalmus maximus)育种提供合适的抗鳗弧菌分子标记。实验鱼经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染,分为非抗病组与抗病组。对两组鱼PCR扩增出的差异条带进行个体统计,再进行微卫星位点与抗鳗弧菌的相关性分析,并分析对比了两组鱼的遗传多样性。结果表明,微卫星位点Sma-USC108、Sma-USC141的等位基因片段分别在215bp和200bp与抗鳗弧菌性状的正相关性极显著,相关系数分别达到0.363和0.407(P0.01);微卫星位点FF0911、Sma-USC62、Sma-USC279的等位基因片段分别在189bp、163bp和236bp与抗鳗弧菌性状的负相关性极显著,相关系数分别达到–0.377、–0.364和–0.363(P0.01)。经过二次验证,最终确定Sma-USC141和FF0911两个微卫星位点可指导大菱鲆抗鳗弧菌的辅助育种。两组大菱鲆的群体遗传多样性分析对比表明:抗病群体与非抗病群体的遗传变异水平较低,两个群体的遗传多样性水平相当。     

盐度对大叶藻种子萌发和幼苗发育的影响

大叶藻海草场是重要生境但在我国严重退化,亟需研究有效的修复方法。本文以桑沟湾的大叶藻种子为研究对象,探讨了盐度急变(0~30)对种子萌发、萌发后继续发育和存活及幼苗幼叶的光合与呼吸速率的影响,为以种子繁殖修复大叶藻海草场提供参考。结果表明:盐度降低促进种子萌发,盐度15及以下效果显著,盐度0时萌发率最高;盐度0~15中萌发的种子均可发育成幼苗,发育和衰亡的比例和速率受萌发盐度背景和萌发后培养盐度的双重影响——较高萌发盐度有利于种子萌发后的发育和存活,种子萌发后于盐度5~30中均可建成幼苗并存活、但在盐度0或1中发育至不同程度后全部死亡。盐度5~30范围内,幼苗幼叶均有净产氧,光合和呼吸作用及净产氧率具随盐度升高而增强趋势。于盐度0或5中萌发、盐度5~30中进一步培育的变盐育苗策略,最高实现了24%或12%的种子于2个月内建成幼苗并继续发育,可作为种子繁殖法修复大叶藻海草场的技术参考。