两种羊膜脱细胞基质制备方法的比较

目的:探究制备羊膜脱细胞基质的方法.方法:取新鲜羊膜标本,分别采用TritonX-100(Triton组)预处理(恒温36 h)和甘油预处理(4℃,24 h×3次),再经胰蛋白酶、EDTA酶消化(分别用时4 h和10 h),制备羊膜脱细胞基质.经HE染色和扫描电镜观察2组羊膜脱细胞基质残留细胞数和组织结构,并观察接种的第3代人脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质上的黏附、生长状况.结果:上述2种方法制备的羊膜脱细胞基质均为白色、半透明膜状物,无细胞及其他组织残留.Triton组羊膜脱细胞基质结构均匀平整,操作时间短.甘油组样本表面凹凸不平,看不到细胞形态.脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质表面黏附、增殖状况均良好,Triton组细胞增殖状况总体优于甘油组(P<0.05).结论:TritonX-100预处理并酶消化法是制备羊膜脱细胞基质较好的方法.     

人脐静脉内皮细胞传代培养方法

内皮细胞在一些生理、病理过程中起重要作用。内皮细胞培养方法广泛用于其形态、功能、代谢的研究。我们采用改良Jaffe法成功传代培养人脐静脉内皮细胞。材料与方法: 内皮细胞分离与培养:用酶消化法分离内皮细胞。取正常娩出胎盘之脐带(20～25cm),置4℃cord缓冲液中保存(一般不超过6h)。操作在超净台     

兔半月板脱细胞基质的制备

目的 制备兔半月板脱细胞基质并研究其组织形态结构及生物力学特性.方法 将切取的兔半月板用双氧水浸泡、蒸馏水洗涤后,采取Triton X-100及脱氧胆酸钠等试剂制备脱细胞的兔半月板,观察其色泽、质地,用苏木精-伊红(HE)、甲苯胺蓝、番红花O、Hoechst-33258荧光染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行组织学检测,用倒置相差显微镜观察其微观三维结构,用生物力学机测定其在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率、最大形变恢复率及最大受压强度.结果 兔脱细胞半月板呈乳白色,结构蓬松,HE、甲苯胺蓝和番红花O染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构,Hoechst-33258荧光染色呈阴性,Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.倒置相差显微镜观察到脱细胞半月板基质内部结构疏松,微孔较多.生物力学测定其压缩40%时,最大瞬时形变恢复率为(76.65±4.61)%,最大形变恢复率为100%,最大强度是(4.51±0.69)N.结论 成功制备的兔半月板脱细胞基质有较多微孔,形变恢复好,有利于细胞附着生长,可作为组织工程支架.     

软骨微粒脱细胞基质的制备及其特性

目的　制备以家猪关节软骨微粒细胞外基质即微粒脱细胞基质 (CartilageMicroparticleAcellularTis sueMatrix ,CMACTM) ,为软骨组织工程提供新型的支架材料。方法　利用氯化钾、去离子水、胰蛋白酶等试剂制备直径为 0 1 0 0～ 0 1 5 4mm的软骨微粒脱细胞基质并寻找胰蛋白酶的最佳浓度及时间。取家猪的新鲜膝、肘关节软骨 6 0 0g ,随机分为 5组 ,每组 8例 ,用不同浓度的胰蛋白酶作用 2～ 36h不等。标本行苏木素 -伊红、胶原染色 ,光镜及扫描电镜观察。结果　微粒软骨脱细胞基质微载体无抗原性成分存在 ,主要含有胶原 ,氨基葡聚糖等混合细胞外基质成分。微粒呈不规则形 ,表面粗糙。胰蛋白酶的最佳含量为 2 5g/L ,最适作用时间为 (1 8 3± 1 6 )h。结论　软骨微粒脱细胞基质含有天然细胞外基质成分 ,是一种体外培养软骨细胞的良好支架。     

一种改进的人脐静脉平滑肌细胞培养方法

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle,VSMC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位.采用培养的VSMC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法.由于人体组织取材限制,很难获取大量原代培养的人VSMC.本室以健康胎儿脐静脉血管为材料,建立起一套完整的人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vein smooth muscle cells,hUVSMC)培养方法,具有周期短,细胞长出率高,可大规模培养等特点.     

人脐静脉内皮细胞分离培养及不同消化酶效力比较

目的采用酶消化法进行人脐静脉内皮细胞分离培养,并比较不同消化酶获得细胞数量及细胞存活率的差别。方法分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶消化获取脐静脉内皮细胞,比较三种酶液消化的结果,在倒置相差显微镜下观察细胞形态特点,同时用Ⅷ因子免疫荧光法和DiI-acLDL摄取实验对所得细胞进行鉴定。结果0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶的最佳消化时间分别为15min、12min、15min,倒置相差显微镜下观察所得细胞呈典型内皮细胞形态,免疫荧光法检测Ⅷ因子相关抗原阳性,且细胞具有DiI-acLDL摄取能力。结论采用酶消化法分离培养脐静脉内皮细胞简便易行,但需严格掌握消化时间以减少细胞损伤,0.1%I型胶原酶是最理想的内皮细胞消化酶。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的:摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法:采用0.25%胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,用含20%FBS的DMEM培养基培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果:原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3～5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论:用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的：摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法：采用0．25％胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,含20％FBSDMEM养基培养,待细胞80％融合后,以O．25％胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果：原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3－5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论：用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。     

猪真皮脱细胞基质制备方法的实验研究

目的 研究猪真皮脱细胞基质的制备方法.方法 实验组使用0.125％胰蛋白酶和2.5 U/mL DispaseⅡ溶液,对照组使用PBS溶液,在4℃下,经过24 h脱去猪真皮细胞,配合0.5％SDS对脱细胞后基质振荡洗涤3 h和0.5％Triton X-100振荡洗涤24 h清除细胞碎片制备出猪真皮脱细胞基质.结果 实验组...     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养方法和注意事项。方法采用0.1%I型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于RPMI-1640和20?S内培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶和0.02?TA消化传代,并以倒置光显微镜观察内皮细胞生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5~7 d后融合成单层,倒置光显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种较可靠的方法,成活率较高,培养的多个环节均需关注。     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞MCPIP表达

目的 探讨同型半胱氨酸是否可以诱导人脐静脉内皮细胞中MCPIP的表达.方法 体外培养并鉴定人脐静脉内皮细胞;分别用10、50、100、200、500 μmol/L Hcy与HUVECs孵育24 h;用100 μmol/L Hcy与HUVECs分别孵育1、2、4、8、12、24 h;Real-time PCR检测MCPIP mRNA的表达,Western blot检测MCPIP蛋白质的表达.结果 Real-time PCR和Western blot分析结果表明,在所设置浓度下,Hcy均可诱导HUVECs中MCPIP的表达（P＜0.05）,其中以100 μmol/L Hcy作用24 h时MCPIP表达量最多;100 μmol/l Hcy与细胞作用2h时后MCPIP表达与对照组相比即有明显增高（P＜0.05）,并存在时间依赖效应.结论 Hcy可诱导HUVECs中MCPIP的表达,这可能与它致As的机理有关.     

灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.     

人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展

<正>血管内皮细胞连续覆在血管内膜,其具有重要的生理功能,广泛参与了炎性反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程~[1]。血管内皮细胞功能失调与许多心血管疾病的发生有关,冠心病的发生与血管内皮细胞的损伤与其功能异常有密切的关系~[2]。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法,是目前最简单可靠的被广泛运用于生理研究的人类血管细胞。随着细胞培养技术不断进步,文献报道了一种仪器,使用     

人脐静脉内皮细胞的培养

目的：培养的内皮细胞为基础和临床研究提供体外模型,并为进一步研究内皮细胞对造血的影响提供实验材料。方法：经胶原酶消化获得人脐静脉内皮细胞,用ＲＰＭＩ－１６４０加２０％的胎牛血清进行培养。结果：成簇状的内皮细胞最初形成于培养皿（或培养瓶）的底层,继而细胞迅速生长,融合成片,约７天细胞呈单层多角形镶嵌排列。透射电镜观察,原代培养细胞的胞质内含内皮细胞特有的细胞器（ＷＰＢｓ）。兔抗人Ⅷ因子相关抗原（ⅧＲ：Ａｇ）免疫组织化学染色实验证实,培养的内皮细胞含有ⅧＲ：Ａｇ。结论：本实验的各项结果从形态,免疫组化及透射电镜的观察均符合内皮细胞的特征,因此确信所培养的内皮细胞可提供作进一步深入的细胞生物学及对造血影响的研究。     

原代人脐静脉内皮细胞的分离培养及其对人巨细胞病毒的易感性研究

目的 通过检测原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径.方法 无菌条件下取30例健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带,向脐静脉灌注0.1%胶原酶Ⅱ 37 ℃消化15 min,通过对细胞的形态学观察和免疫荧光染色方法对细胞进行纯度鉴定;用HCMV病毒株体外感染HUVEC,通过对HCMV基因及蛋白检测确定HUVEC对HCMV的易感性.结果 0.1%胶原酶Ⅱ、15 min的消化方法对HUVEC有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明HUVEC细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达; HCMV体外感染HUVEC 72 h后形态学有明显改变,病毒基因及蛋白均有阳性表达.结论 原代HUEVC对HCMV易感,通过脐静脉的血液传播可能是胎儿宫内感染HCMV的重要途径之一.     

人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定

目的 改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法 采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0．125％、0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果 0．125％、0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min，倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论 胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0．1％胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。     

人脐静脉内皮细胞的继代培养

目的：研究人血管内皮细胞在体外长期传代培养的方法，方法；采用０．１２５％胰酶ＥＤＴＡ液灌注冲洗法，从人脐静脉中分离在管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）；用０．０２％ＥＤＴＡ消化传代ＥＣ，用新生小牛视网膜提取物（ＲＤＳ）作为生长促进剂。应用光镜，电镜，免疫组化等方法对原代和继代内皮细胞进行鉴定和生长特性观察，结果：人脐静脉内皮细胞继代培养３６代，原代和继代内皮细胞胞浆中含有Ｗ－Ｐ小体和Ⅷ因子相关抗原；传代ＥＣ