miR-320a调控非小细胞肺癌细胞的上皮细胞间质化过程研究

 目的 探讨miR-320a对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞上皮细胞间质化过程的调控作用及其可能的作用机制。方法 选取2017-07至2018-12于菏泽市立医院住院并进行手术治疗的NSCLC患者60例,术中取切除的癌组织和癌旁组织,RT-PCR和Western Blot检测癌组织和癌旁组织miR-320a和FoxM1表达;miR-320a mimics、miR-320a NC和miR-320a inhibitor转染A549细胞,24 h后划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力,双荧光素酶报告基因系统预测miR-320a与FoxM1的靶向关系,Western Blot检测FoxM1、E-Cadherin和Vimentin蛋白表达。结果 癌旁组织内miR-320a的表达高于癌组织(P<0.001),FoxM1的阳性细胞率低于癌组织(P<0.001);miR-320a NC组细胞迁移和侵袭能力低于miR-320a mimics组(P<0.001),而高于miR-320a inhibitor组(P<0.001);miR-320a可靶向下调FoxM1的表达水平;FoxM1-WT A549细胞中,miR-320a mimics组细胞E-cadherin表达显著高于miR-320a NC组(P<0.001),Vimentin表达显著低于miR-320a NC组(P<0.001);miR-320a inhibitor组细胞E-cadherin表达显著低于miR-320a NC组(P<0.001),Vimentin表达显著高于miR-320a NC组(P<0.001)。结论 miR-320a在NSCLC中可能作为抑癌基因发挥作用,这种作用可能是通过靶向抑制FoxM1的表达,从而抑制NSCLC细胞的上皮细胞间质化过程而实现的。     

miR-30a-5p和NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

 目的 研究miR-30a-5p和靶基因NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响。方法 收集2016-09至2019-03在保定市第一医院行手术切除治疗的非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织标本64例,QPCR和Western blot分别检测非小细胞肺癌组织样本和细胞中miR-30a-5p和NUAK1的表达;TargetScan网站预测miR-30a-5p与NUAK1间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验和Western blot进行验证;MTT和Transwell实验检测miR-30a-5p及联合过表达NUAK1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 非小细胞肺癌组织中miR-30a-5p的相对表达量(0.33±0.14)低于癌旁组织(1.00±0.21),差异有统计学意义(t=21.237,P＜0.05);非小细胞肺癌组织中NUAK1 mRNA表达(4.13±1.87)和蛋白表达(3.41±1.62)均高于癌旁组织(1.00±0.17、1.00±0.16),差异有统计学意义(t=13.335、11.844,P＜0.05)。非小细胞肺癌细胞系H460、H1299、A549中miR-30a-5p表达量(0.35±0.03、0.51±0.05、0.28±0.03)低于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(1.00±0.11),差异有统计学意义(F=77.100,P＜0.05);H460、H1299、A549细胞中NUAK1 mRNA相对表达量(2.98±0.30、2.39±0.24、3.42±0.36)和蛋白相对表达量(3.06±0.31、2.27±0.23、4.12±0.41)均显著高于BEAS-2B细胞(1.00±0.09、1.00±0.11),差异有统计学意义(F=46.660、63.070,P＜0.05)。结论 miR-30a-5p可通过靶向NUAK1抑制非小细胞肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭,提示miR-30a-5p和NUAK1可能成为一种新的临床诊断和治疗非小细胞肺癌的靶点。     

小RNA干扰沉默S100A13对甲状腺细胞侵袭、迁移的影响及机制

 目的 探究干扰钙结合蛋白A13(calcium binding protein A13, S100A13)基因表达对甲状腺癌TPC-1细胞侵袭、迁移的影响及可能作用机制。方法 采用小RNA干扰敲减甲状腺癌TPC-1细胞S100A13基因的表达,通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测S100A13对TPC-1细胞迁移能力的影响,Transwell侵袭实验检测S100A13对TPC-1细胞侵袭能力的影响,免疫印迹试验(Western Blot)检测S100A13、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、钙黏蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达。结果 与对照组相比,采用小RNA干扰的人甲状腺癌TPC-1细胞划痕宽度显著升高(25.214±2.687 vs 69.223±5.291),侵袭(0.897±0.082 vs 0.521±0.053)、迁移(1.263±0.252 vs 0.759±0.062)能力显著降低(P<0.05),细胞中MMP-2(0.523±0.062 vs 0.246±0.033)、Vimentin(0.863±0.082 vs 0.458±0.053)蛋白表达显著降低(P<0.05),E-cadherin(0.445±0.053 vs 0.755±0.078)蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论 采用小RNA干扰S100A13表达可抑制甲状腺癌TPC-1细胞的侵袭、迁移,可能与其下调上皮间质转化和MMP-2的表达有关。     

miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响

 目的 探讨miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响。方法 选取2019-03至2020-05在空军军医大学唐都医院外科进行脊柱手术的骨质疏松患者20例(骨质疏松组),同时选取非骨质疏松症患者20例为对照组,抽取两组骨髓血。将miR-214-5pmimics(miR-214-5pmimics组)、miR-214-5p空质粒(miR-214-5pvector组)、shZFAS1载体(sh PTEN组)、shZFAS1空载体(sh vector组)转染到骨质疏松患者细胞,对照组细胞不进行任何转染处理。采用RT-qPCR 检测骨髓单个核细胞中的miR-214-5p和PTEN mRNA及 Raw264.7单核巨噬细胞中NFaTc1、MMP9、TRAP、CTSK的mRNA水平;通过TRAP染色检测TRAP染色的阳性率;通过Western blot 检测PTEN、NFATc1、AKT和PI3K蛋白水平。结果 骨质疏松组miR-214-5p水平的表达明显高于对照组(P＜0.001),骨质疏松组PTEN的表达显著低于对照组(P=0.009);miR-214-5pmimics组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和miR-214-5p vector组(P＜0.001);sh PTEN组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和sh vector组(P＜0.001);miR-214-5p mimics组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);sh PTEN组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);与miR-214-5p mimics组相比,miR-214-5pmimics+PTEN组中TRAP表达阳性率显著降低(P＜0.001)。结论 骨质疏松症患者的骨髓单个核细胞中miR-214-5p表达上调,miR-214-5p可以调控PTEN表达,过表达miR-214-5p可能通过靶向PTEN促进破骨细胞分化。     

辐射诱导miR-1246对宫颈癌HeLa细胞上皮间质转化作用

目的探讨辐射诱导的miR-1246对宫颈癌He La细胞上皮间质转化(EMT)的作用。方法经不同剂量~(60)钴(~(60)Co)γ射线辐射处理的宫颈癌He La细胞,采用qRT-PCR检测miR-1246的表达水平。借助miR-1246及miR-1246-inhibition慢病毒表达载体,调变miR-1246在He La细胞中的表达水平,然后应用划痕实验及Transwell侵袭实验比较He La细胞的转移和侵袭能力;Western blot实验检测细胞中EMT相关分子的表达情况。结果辐射可诱导miR-1246在宫颈癌He La细胞中表达(P<0.05)。上调miR-1246表达,He La细胞出现间质细胞的形态改变,同时,细胞迁移能力增强,侵袭能力提高。在He La细胞中miR-1246表达上调,可降低细胞中E-cadherin的表达(P<0.05),同时升高N-cadherin的表达(P<0.05)。结论辐射可诱导miR-1246在宫颈癌He La细胞中表达,miR-1246通过调控E-cadherin和N-cadherin的表达促进宫颈癌HeLa细胞发生EMT。     

高压氧通过下调miR-720表达抑制卵巢癌SKOV-3细胞恶性生物学行为的研究

目的探讨高压氧(HBO)处理对卵巢癌SKOV-3细胞miR-720的表达及其恶性生物学行为的影响。方法卵巢癌SKOV-3细胞按照实验设计分为对照组和HBO组, 对照组SKOV-3细胞常规培养, HBO组SKOV-3细胞常规培养完成后予以0.2 MPa HBO处理。同时将培养好的卵巢癌SKOV-3细胞按照随机数字表法再分为3组, 正常对照(NC)组、HBO组和HBO+miR-720组, 其中HBO组按照HBO条件进行培养, HBO+miR-720组在HBO处理前转染miR-720质粒, HBO组和NC组同时转染NC质粒, 转染24 h后收集细胞进行后续实验。应用qPCR检测SKOV-3细胞miR-720 mRNA表达水平, 应用Western印迹法检测SKOV-3细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、E-cadherin、Vimentin)和miR-720蛋白的表达水平, 应用CCK-8法检测SKOV-3细胞增殖能力, 应用克隆形成实验检测SKOV-3细胞克隆形成能力, 应用细胞划痕实验和Transwell实验检测SKOV-3细胞侵袭和迁移能力。结果应用HBO处理...     

长链非编码RNA双特异性磷酸酶5假基因1对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的作用

目的 探讨长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）双特异性磷酸酶5假基因1（dual-specificity phosphatase 5 pseudogene 1,DUSP5P1）对三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）细胞生物学行为的作用。方法 采用实时荧光定量PCR法检测TNBC细胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468及正常人乳腺导管上皮细胞MCF-10A中lncRNA DUSP5P1的表达水平;将MDA-MB-231细胞系分为对照组、sh-vector组和sh-DUSP5P1组,分别不感染慢病毒、只感染空载质粒及感染sh-DUSP5P1-慢病毒（lentivirus,lenti）。采用MTT实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,Western Blot实验检测上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin、Snail的表达。结果 TNBC细胞系MDA-MB-231、4T1及MDA-MB-468中lncRNA DUSP5P1的表达水平均明显高于正常人乳腺导管上皮细胞系MCF-10A（F=65.10,P<0.05）。细胞培养12、24、48、72 h后,sh-DUSP5P1组吸光度值（OD490值）明显低于对照组和sh-vector组（分别F=33.62,90.72,41.17,77.94;均P<0.05）。细胞培养7 d后,与对照组和sh-vector组比较,sh-DUSP5P1组克隆形成数明显下降（F=575.1,P<0.05）。敲减DUSP5P1后,TNBC细胞系MDA-MB-231侵袭和迁移能力明显下降（分别F=933.30,160.20;均P<0.05）,上皮标志物E-cadherin明显上升（F=6.21,P<0.05）,间质标志物Vimentin和Snail明显下降（分别F=100.11,227.37;均P<0.05）。结论 LncRNA DUSP5P1可能通过上皮间质转化过程促进TNBC细胞侵袭和迁移。     

紫花前胡苷调控EMT对宫颈癌细胞侵袭迁移的影响及其作用机制

目的 探讨紫花前胡苷（NDK）通过调控上皮-间质转化（EMT）影响宫颈癌细胞侵袭迁移的可能机制,并分析其对miR-324-3P/WNT3a轴的影响。方法 取对数生长期人宫颈癌HeLa细胞,分为4组：空白组（于37 ℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养）、miR-324-3P inhibitor组(转染_{hsa-miR-324-3p} inhibitor)、NDK组（加入20 mmol/L浓度的NDK培养）、miR-324-3P inhibitor+NDK组(转染_miR-324-3P inhibitor后加入20 mmol/L浓度的NDK培养),均处理48 h。采用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力;qRT-PCR检测各组细胞中_miR-324-3P、_{WNT3a mRNA表达}水平;Western blotting检测各组EMT相关标志蛋白E-钙黏素（E-cadherin）、波形蛋白、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、WNT3a、β-ca...     

miR-19a-3p靶向调控CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3信号通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制

 目的 探究miR-19a-3p靶向CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制。方法 癌细胞分组转染(空白组、阴性对照组、miR-19a-3p mimic组、siRNA-CCND1组、miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1组)。分别应用qRT-PCR、Western blot、MTT、划痕实验和Transwell侵袭实验检测相关基因mRNA和蛋白表达及细胞生物学行为变化趋势。结果 人乳腺癌组织和细胞中CCND1和Fra-1的表达明显上升,而miR-19a-3p明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组和阴性对照组相比,另外3组的miR-19a-3p、CCND1、FrA-1表达水平均上调(P<0.05),miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组中上调更为明显(P<0.05)。各组细胞在24 h时无明显差异。48 h和96 h各组细胞增殖能力均提高。空白组与阴性对照组细胞增殖能力相比无明显差异。另外3组的细胞增殖能力均明显增强,差异有统计学意义(P<0.05),但miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组中细胞增殖变化趋势较弱,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组和阴性对照组相比,另外3组细胞迁移、侵袭能力均减弱,差异有统计学意义(P<0.05),且miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组迁移、侵袭能力最弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-19a-3p在乳腺癌中呈下降趋势,上调miR-19a-3p可有效抑制CCND1基因表达和FrA-1/IL-6/Stat3通路激活,从而降低乳腺癌细胞侵袭转移。     

LINC01296/miR-1255b-5p促进非小细胞肺癌进展的研究

目的 探究下调LINC01296的表达对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）进展的影响,以及LINC01296调控miR-1255b-5p在NSCLC发生发展中的分子机制。方法 培养6种NSCLC细胞系;实时荧光定量聚合酶链反应法检测LINC01296在NSCLC细胞系以及在48例患者样本中表达水平的高低;细胞计数试剂盒-8法检测稳转细胞株的细胞增殖情况;克隆形成实验检测细胞的生长以及增殖状况;划痕实验检测细胞的迁移情况;FITC-Annexin-V法检测细胞凋亡;动物实验,包括裸鼠尾静脉和皮下瘤注射,观察癌细胞的转移以及成瘤情况;双荧光素酶报告基因实验验证LINC01296与miR-1255b-5p之间存在靶向结合关系。 结果 LINC01296在NSCLC中高表达;LINC01296基因敲低抑制NSCLC细胞生长、迁移;LINC01296敲低抑制体内瘤体的生长和转移;LINC01296与miR-1255b-5p的之间存在海绵吸附作用;LINC01296与miR-1255b-5p的表达呈负相关。结论 LINC01296作为NSCLC的促癌分子,通过抑制miR-1255b-5p的表达水平,促进了NSCLC的发展。     

尿液miR-17-5p检测对膀胱癌的诊断价值

目的探讨膀胱癌患者尿液中微小核糖核酸17—5p（miR-17-5p）表达及其诊断价值。方法运用荧光定量PCR检测miR-17-5p在膀胱癌患者尿液中的表达水平,采用△△CT方法计算膀胱癌患者与正常人尿液中miR-17．5p表达量的比值,结合术后病理参数,统计分析miR-17-5p与临床病理资料的相关性。结果膀胱癌患者尿液中miR-17-5p表达较正常人明显升高。26例膀胱癌患者中18例（69．2％）的miR-17-5p表达较正常人显著升高,且与肿瘤大小和恶性程度相关,肿瘤越大、恶性程度越高,尿液中miR-17-5p的表达量越高。结论尿液中高表达miR-17—5p可能成为诊断膀胱癌的重要标志物,并与膀胱癌的临床病理密切相关,可能对膀胱癌的诊断提供新的思路。     

胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中microRNA差异表达研究

目的筛选胃癌干性相关的mircoRNA(miRNA),探讨其差异表达的意义。方法体外成球实验筛选胃癌干细胞,应用miRNA芯片技术筛选spheroid及attachment培养胃癌细胞株MKN-45差异表达的miRNA。同时,选取10例新鲜胃癌组织及其癌旁组织运用qRT-PCR对差异表达的miRNA进行验证。运用靶基因预测软件预测差异表达miRNA可能的调控靶基因。结果筛选得到胃癌干细胞较胃癌细胞表达明显上调的miRNA共有7个,分别为miR-29a-3p、miR-21-5p、miR-22-3p、miR-4270、miR-483-5p、let-7b-3p、miR-34a-5p。7个miRNA在球体细胞与亲代贴壁细胞间的相对表达量存在明显差异。其中,miR-29a-3p、miR-21-5p、miR-22-3p、miR-4270、miR-483-5p的表达水平与芯片检测结果一致,符合率71%;let-7b-3p、miR-34a-5p的表达水平与芯片检测结果不一致。MiRanda、Target Scan及Pictar在线数据库的交集中,miR-27a-3p、miR-34a-5p、miR-21-5p、miR-4270、let-7b-3p以及miR-29a-3p可预测到靶基因,而miR-483-5p与miR-16-5p未能预测到靶基因。结论miRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中存在特异性的表达谱,其差异表达的miRNA可能与胃癌耐药相关,可作为诊断胃癌和评判预后的重要标准,并为抵胃癌耐药提供可能靶点。     

长链非编码RNA ZFAS1在食管癌中的表达及作用机制研究

目的探讨长链非编码RNA锌指结构反义转录本1（zinc finger antisense 1,ZFAS1）在食管癌中的表达及作用机制。方法采用实时荧光定量PCR法分别检测癌旁组织和食管癌组织、正常食管上皮细胞和食管癌细胞的ZFAS1表达水平,通过细胞增殖活性检测、细胞划痕实验及流式细胞仪检测细胞凋亡技术,评价干扰食管癌细胞表达ZFAS1对细胞增殖、迁移及凋亡的影响,采用荧光素酶报告基因验证微小RNA（microRNA,miRNA）miR-302b-3p是ZFAS1的作用靶点,Western蛋白印迹法检测ZFAS1及miR-302b-3p作用下c-Jun氨基末端激酶2（c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2）、胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R）、白细胞介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4）和上皮细胞激酶（epithelial cell kinase 2,EphA2）蛋白的表达变化。结果与癌旁组织相比,食管癌组织表达ZFAS1水平升高（t=19.40,P<0.001）,与正常食管上皮细胞相比,食管癌细胞表达ZFAS1水平增加（t=13.80,P<0.001）,通过抑制细胞表达ZFAS1发现,与NC干扰组相比,显著降低ZFAS1干扰组细胞增殖活性（t值分别=2.933,8.568,10.04,均P<0.05,）及迁移能力（t=13.96,P<0.001）,且细胞凋亡率升高（t=10.68,P<0.001）。ZFAS1可通过靶向miR-302b-3p调节JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2蛋白的表达。结论ZFAS1在食管癌组织中表达显著增加,具有促进食管癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的能力,且ZFAS1可通过靶向miR-302b-3p激活JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2,有望成为治疗食管癌的潜在靶点。     

靶向LETMD1的miR-494对宫颈癌发病的作用

 目的 探讨靶向作用于LETMD1的miR-494对宫颈癌发病的作用。方法 选取2017-09至2018-03诊断为原发性宫颈癌、接受根治性子宫切除及盆腔淋巴结清扫术30例的病理标本,另选取同期因妇科良性疾病行全子宫切除30例的正常宫颈组织病理标本。检测癌组织及正常组织中 miR-494和 LETMD1的表达。结果 miR-494在宫颈癌组织中含量明显降低,与LETMD1表达呈明显负相关,且miR-494与肿瘤患者FIGO分期明显相关(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实miR-494直接作用于LETMD1 mRNA的3′UTR。集落形成试验证实miR-494通过靶向作用LETMD1抑制宫颈癌细胞的增殖。结论 宫颈癌患者miR-494与FIGO分期明显相关,miR-494可通过靶向作用于LETMD1 抑制宫颈癌细胞的增殖。     

冷冻消融后残存肿瘤与上皮-间质转化关系的实验研究

目的 探究不完全冷冻消融对前列腺癌RM-1细胞生物学行为的影响及其产生机制.方法 前列腺癌RM-1细胞放入-20℃冰箱中冷冻5 min,37℃水域复温,待细胞状态恢复后重复冷冻10 min、15 min.培养ld后镜下观察细胞形态.20只C57/BL小鼠构建荷瘤模型,随机分为对照组与不完全冷冻消融组.不同时间点测量肿瘤大小,14d时处死小鼠、取肺组织行HE染色,统计肿瘤肺转移枚数.Transwell法检测细胞迁移及侵袭能力变化,免疫印迹检测相关蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液转化生长因子(TGF)-β分泌量.结果 经不完全冷冻消融的RM-1细胞排列紊乱,形态发生改变,可有触角结构形成.术后3、7d不完全冷冻消融组肿瘤体积略小于对照组,但仅术后7d差异有统计学意义(P=0.019),术后10、14 d肿瘤体积基本相等.不完全冷冻消融组肿瘤肺转移枚数明显多于对照组(P＜0.001).Transwell试验显示不完全冷冻消融组细胞迁移及侵袭能力强于对照组(P＜0.05).免疫印迹检测显示,不完全冷冻消融组与对照组相比,N-cadherin、MMP-9、vimentin、表达上调,E-cadherin表达下调.ELISA检测结果显示,不完全冷冻消融组细胞上清液中TGF-β分泌增多.结论 不完全冷冻消融可使RM-1细胞迁移及侵袭能力增强,增加荷瘤小鼠肿瘤肺转移枚数,影响上皮-间质转化相关蛋白表达.