新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

远志皂苷元对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的观察远志皂苷元对体外培养的胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法利用无血清DMEM/F12 体外培养技术从新生Wistar 大鼠大脑海马中培养NSCs,添加不同浓度(0、1、2、4 μg/ml)远志皂苷元。应用免疫荧光技术对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果培养的NSCs能够表达Nestin,并具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。在同一接种密度条件下,远志皂苷元干预组的Nestin 阳性细胞数较对照组减少(P<0.05),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数较对照组增加(P<0.05)。结论远志皂苷元能促进新生大鼠大脑海马NSCs的分化。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的 神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础，从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，并观察其向神经元的分化情况。方法 分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织，采用无血清原代及传代培养方法，获得具有克隆能力的细胞群；应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达；应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果 从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力，表达神经上皮干细胞蛋白(nea6n)，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；随着贴壁后分化时间的延长，表达nestin的细胞数量从80．5％下降到10．9％，向神经力特异性烯醇化酶(newonspecific enolase，NSE)阳性细胞数量则从1．1％上升到31．6％。结论 用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；随着分化时间的延长，神经干细胞数量下降，而神经元比例有明显上升。     

脉冲强磁场诱导体外新生大鼠神经干细胞向神经元方向分化

目的探讨脉冲强磁场对体外新生大鼠神经干细胞（NSCs）向神经元方向分化的作用。 方法体外分离培养新生3d内的SD大鼠脑室下区的NCSs,无血清培养14d后,随机分为实验组和对照组。实验组置于脉冲强磁场条件下用前期探索的促增殖参数（0.1Hz、4T、8次）进行干预,每次脉冲放电20ms。对照组置于相同条件下但不做干预处理。干预后第1天,采用10%胎牛血清诱导贴壁分化,显微镜下观察不同时间段细胞形态学变化;贴壁分化后第7天,通过免疫荧光染色、蛋白免疫印迹法（Western Blot）及实时定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测NCSs分化后第7天神经元βⅢ微管蛋白（TUJ1）及星形胶质细胞相关特异性标志神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果干预后,免疫荧光染色示实验组TUJ1阳性细胞数为（33.4±5.1）%,较对照组［（26.5±7.0）%］明显增多(P<0.05),实验组的GFAP阳性细胞率［（23.9±5.0）%］较对照组［（36.2±2.2）%］明显减少 (P<0.05)。RT-PCR检测显示,实验组TUJ1的mRNA表达量是对照组的（1.682±0.086）倍,GFAP的mRNA相对表达量是对照组的（0.590±0.157）倍,且组间差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测结果与RT-PCR检测一致,实验组TUJ1蛋白表达较对照组增多,GFAP蛋白表达较对照组减少。 结论脉冲强磁场具有促进NCSs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化的作用。     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化神经细胞的实验研究

目的探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法无菌取成熟大鼠长骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞，在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定。结果骨髓基质细胞能在神经干细胞条件培养基中增殖、分化，表达巢蛋白抗体抗原，在适宜诱导分化因子及条件下进一步分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经细胞特异性核蛋白抗体抗原表达阳性。结论在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，骨髓基质细胞可成功诱导出神经元样细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

源于成人骨髓神经干细胞诱导分化的实验研究

目的研究成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性,为进一步自体移植治疗脑退行病变的临床应用奠定基础。方法以20例成年男/女性(28～48岁)骨髓自愿捐献者为取材对象,骨穿术后经梯度密度离心分离获取的成人骨髓基质细胞用“Cytokine·神经干细胞培养液”培养,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以巢蛋白(Nestin),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)、白血病抑止因子(LIF)(10μg/L)和维A酸(RA)(0.5mg/L)等。结果成人骨髓基质细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为神经干细胞,并由含粗大胞质颗粒的多个神经干细胞组成岛屿状细胞球(神经球),该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球。神经干细胞球进一步分化,则可见到有的细胞胞体增大并出芽、逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网,分化的长突起细胞表达NSE或GFAP。结论成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性。     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞的研究是最近几年来神经科学及胚胎发育学的热点问题。人们通常认为成年哺乳动物的中枢神经系统组织是不可再生的，中枢神经系统损伤或神经系统退行性病变将只能由神经胶质爬行替代，遗留难以弥补的神经系统功能缺损。而神经千细胞特别是在成年哺乳动物中枢神经系统中发现的神经千细胞对以上观点产生了巨大的冲击。随着神经干细胞的研究深入，必将为神经系统损伤性、退行性疾病的彻底治愈，甚至神经移植治疗带来一次革命性突破。     

体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化的特征

目的：骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现具有重要的临床应用价值，可用其作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞，以解决供体缺乏，同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多问题。为此，实验模拟肝脏发育的微环境，观察体外诱导分化大鼠骨髓干细胞为肝干细胞的可行性及特征。 方法：实验于2006—10／2007-08在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成。①实验动物：SPF级SD大鼠，2月龄，体质量（200&;#177;20）g，雌雄不拘，购于上海斯莱克实验动物公司。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度分离法分离培养大鼠骨髓干细胞，并设诱导组和非诱导组，应用25μg／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维生长因子-4、10μg／L干细胞生长因子共同诱导。③实验评估：于诱导第0，7，14，21，28天，观察细胞形态变化，采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度，免疫组织化学染色检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的表达，应用流式细胞仪检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19表达阳性细胞比例。 结果：①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变。②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高，第14天达高峰，随后呈下降趋势，与非诱导组相比，除第O，7天无差异，其余各时间点差异均显著（P〈0．05）。③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白，非诱导组不表达3种蛋白。④流式细胞分析诱导组甲胎蛋白阳性细胞比例为66．20％、细胞角蛋白19阳性细胞的比例为44．96％。 结论：在实验建立的诱导培养体系中，骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞，诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。     

新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性

目的：观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性。 方法：实验于2005—11／2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成。①在无菌条件下，利用显微解剖分离新生小鼠（出生后2d内）脊髓，采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液，离心，弃去上清液，加入于细胞培养液（含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，B27辅助培养液），以1&;#215;10^8L^-1。密度接种于25mL培养瓶中，进行原代培养。②将原代培养7d左右的细胞再次离心。弃去上清，加入干细胞培养液，机械吹打成单细胞悬液，以5&;#215;10^7L^-1密度进行传代培养海六七天传代1次。③机械吹打制成的单细胞悬液．经过传代培养。重新增殖为神经球，采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞，用体积分数为0．1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后，用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白，胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况。 结果：①脊髓源性神经千细胞形态学观察：在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块，称之为“神经细胞球”；随着培养时间的延长和多次传代换液，细胞增殖迅速，神经细胞球数目明显增多。②脊髓神经干细胞的分化与鉴定：将神经球转入含体积分数为0．1的胎牛血清的培养液中。数小时内迅速贴壁并开始分化，5d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态；免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性。 结论：新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞。它们可以在体外大量增殖，经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化。     

新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性

目的:观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性。方法:实验于2005-11/2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成。①在无菌条件下,利用显微解剖分离新生小鼠(出生后2d内)脊髓,采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液,离心,弃去上清液,加入干细胞培养液(含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,20μg/L表皮生长因子,B27辅助培养液),以1×108L-1密度接种于25mL培养瓶中,进行原代培养。②将原代培养7d左右的细胞再次离心,弃去上清,加入干细胞培养液,机械吹打成单细胞悬液,以5×107L-1密度进行传代培养,每六七天传代1次。③机械吹打制成的单细胞悬液,经过传代培养,重新增殖为神经球,采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,用体积分数为0.1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白,胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况。结果:①脊髓源性神经干细胞形态学观察:在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块,称之为“神经细胞球”;随着培养时间的延长和多次传代换液,细胞增殖迅速,神经细胞球数目明显增多。②脊髓神经干细胞的分化与鉴定:将神经球转入含体积分数为0.1的胎牛血清的培养液中,数小时内迅速贴壁并开始分化,5d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态;免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性。结论:新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们可以在体外大量增殖,经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化。     

当归对宫内缺氧新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响

背景:实验小组前期研究发现孕鼠宫内缺氧可刺激胎鼠神经干细胞的增殖,缺氧6 h时增殖达高峰,在9 h也表现增殖,但能力开始下降.而缺氧达12 h时即表现为坏死或凋亡,但随缺氧天数的延长及时段的不同,对神经干细胞的影响又如何?目的:进一步探讨宫内缺氧对新生大鼠神经干细胞增殖、分化的影响及当归注射液的保护作用.方法:孕SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组.孕14 d开始将当归组与缺氧组孕鼠置于三气培养箱中,制作缺氧性脑损伤新生鼠模型,此前1 h分别给于当归注射液和生理盐水尾静脉注射,对照组不缺氧,余同缺氧组.孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织,经胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色后行图像分析.结果与结论:①缺氧组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应对照组增加;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组减小.②当归治疗组新生鼠海马胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞的表达较相应缺氧组减少;而神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学阳性细胞的表达较对照组增大.结果表明,一定程度的缺氧可刺激神经干细胞增殖,并可刺激神经干细胞向神经胶质细胞分化,以及导致神经元的减少;当归注射液可减弱由于缺氧导致的神经干细胞的增殖和向胶质细胞分化的能力,并可缓解神经元的减少,提示当归可能对缺氧大鼠神经系统有一定的保护作用.     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的:从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆,对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定,检测所分离细胞群的增殖分化特性。方法:实验于2005-07/10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只,利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后,以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。结果:实验选用昆明种新生24h内小鼠12只,全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化:神经干细胞以神经球的方式悬浮生长,无明显突起,原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满,活力状态好,绝大多数在1d内贴壁,并从细胞球边缘伸出突起,加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化,克隆球周围有细胞移出,7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果:原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色,证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性;细胞经BrdU标记后,行BrdU免疫细胞化学染色,部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定:对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测,表达均呈阳性。结论:成功分离并获得新生小鼠脑海马神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

大鼠神经干细胞与"癫痫样细胞"体外共培养后的分化发育料

背景:在癫痫微环境神经干细胞能否被诱导分化为异常放电的"癫痫神经元"?癫痫微环境包括两种情况:一是"无镁"细胞外液,二是与癫痫细胞共培养.其中前者比后者的致癫痫作用强.目的:模型模拟体内癫痫微环境,将大鼠海马神经干细胞和正常海马神经元以及"癫痫神经元"体外共培养,观察干细胞的分化发育情况.设计:重复测量观察.单位:哈尔滨医科大学附属第一医院.材料:实验于2005-08/2007-04在哈尔滨医科大学病原学教研室及药理学教研室完成,选用150只新生Wistar大鼠,雌雄不拘,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.兔抗鼠突触素抗体购自美国LabVision公司.携带增强型绿色荧光蛋白标记基因的血清型2型腺相关病毒购自北京本元正阳公司.Axopatch 200B放大器为美国Axon公司产品.5111A示波器为美国Tektronix公司产品.方法:①分离大鼠海马神经元,采用"无镁"外液处理神经元建立"癫痫神经元"模型.常规方法培养大鼠海马神经干细胞,将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、"癫痫神经元"共培养14 d.②应用膜片钳记录与两种神经元共培养后细胞突触后电位:利用免疫荧光检测神经干细胞突触素抗体染色情况:将神经干细胞分化的神经元放入"无镁"外液,应用膜片钳记录其突触后电位.主要观察指标:①海马神经干细胞与两种神经元共培养14 d后突触后电位、突触素抗体染色结果.②分化后神经元在.无镁"外液中突触后电位及"癫痫样放电"情况.结果:①神经干细胞与正常海马神经元共培养后,膜片钳记录到60%(6/10)神经干细胞14次/5min兴奋性突触后电位;与"瘴痫神经元"共培养后记录到12次/5 min兴奋性突触后电位.②神经干细胞分别与正常海马神经元及"癫痫神经元"共培养后,免疫荧光检测均显示80%(12/15)表达绿色荧光蛋白的干细胞突触索抗体染色阳性.③60%(9/15)干细胞分化的神经元在"无镁"外液中出现14次/5 min时程约10 s的兴奋性突触后电位,未记录到"癫痫样放电".结论:大鼠海马神经干细胞与"癫痫神经元"体外共培养后可形成功能性突触,未转变成"癫痫神经元".     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景:神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的:观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法:从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论:从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。