栽培花生品种间SSR标记多态性及特征分析

通过筛选栽培花生间具有多态性的SSR,分析总结多态性SSR的特征,旨在选择性利用SSR标记,推动栽培种花生遗传图谱构建、相关农艺性状的QTL定位和分子标记辅助育种进程。以秦皇岛光秧、石腰豆、印度窄叶、抗019、四粒红和黑花生6个不同植物学类型的中国栽培种花生为材料,选用不同设计类型的1 523个SSR标记筛选品种间多态性SSR,并对其扩增片段长度、重复基序、重复次数等进行分析。结果表明,1 523个标记中,筛选获得43对多态性SSR标记,产生123个多态性标记位点,多态性标记数占2.8%。43对多态性SSR标记中,以ARS××的多态性最高,在6个品种中多态率达6.8%。统计各种质间具多态性的SSR,其中石腰豆与四粒红间多态性最高,共筛选到56个多态性标记位点;秦皇岛光秧与印度窄叶间多态率最低,筛选到21个多态性标记位点。在123个多态性SSR标记位点中,80%多态性SSR位点片段长度为150~300 bp;18.8%多态标记的重复基序为GA,其次为AG、TC,分别占12.5%,12.5%;多态标记中二核苷酸、三核苷酸重复基序的重复次数在15次以上的占60%。     

花生栽培种SSR遗传图谱的构建

花生栽培种品种间分子多态性相对缺乏, 至今未构建出较完整的分子遗传图谱。本研究以粤油13和阜95-5为亲本, 通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。采用652对genomic-SSR引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测, 从中筛选出121对多态性引物, 在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析, 获得包含108个SSR标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记), 涉及20个连锁群, 总长568 cM, 平均图距为6.45 cM的花生栽培种遗传图谱。与前人构建的花生野生种(A. duranensis × A. stenosperma, AA genome)SSR遗传图谱比较, 初步确定本研究构建的遗传图谱中有11个连锁群与野生种遗传图谱的6个连锁群存在同源关系。     

利用SSR分子标记鉴定若干玉米自交系的亲缘关系

利用SSR分子标记技术对当前和过去广泛应用的12个玉米自交系进行遗传多样性分析,并划分了杂种优势群。在SSR分析中,选用107对基本均匀分布在玉米10条染色体上的扩增带清晰且具有多态性的SSR引物,在供试材料中共检测出419个等位基因变异,平均每对引物检测出3．9个等位基因,平均多态性信息量为0．60。聚类分析将12个自交系划分为6类,即Ⅰ(综31,综3,自330,Va35)、Ⅱ(吉63,旅28),Ⅲ(黄早四,大秋36)、Ⅳ(B73),Ⅴ(太183),Ⅵ(87-1,P138)。研究结果表明,用SSR标记划分杂种优势群与自交系系谱关系基本一致。来自于综合种的综31、综3在本研究中被归为Ⅰ类,它们与组成综合种的亲本自交系的关系依次为与自330最近,其次为Va35,而与吉63、黄早四、旅28、B73、大秋36、太183的亲缘关系较远。新选系综31、综3与其亲本系相比与Ⅵ类杂交可产生更大的优势。     

利用SSR分子标记分析彩色小麦的亲缘关系与遗传多样性

为探讨彩色小麦的亲缘关系和遗传多样性, 利用305对多态性SSR引物检测了18个彩色小麦品种(系)。共检测到1 084个等位变异, 平均每对引物检测到3.6个。红粒、紫红粒小麦的等位变异数在7个部分同源群的排序为HG3>HG2>HG1>HG4>HG5>HG7>HG6, 黑粒和蓝粒小麦的排序为HG3>HG2>HG1和HG4>HG5>HG7>HG6。不同粒色小麦的SSR标记多态信息含量相近, 其中红粒和紫红粒小麦为0.525~0.543, 黑粒和蓝粒小麦为0.517~0.545。18个品种(系)的遗传差异极显著(P=0.0001), 遗传相似系数在0.41~0.76之间。UPGMA聚类分析将18份材料分为6群,类群分布与亲缘关系及其地域相关。     

野生花生遗传物质渗入到栽培种的分子证据

花生属野生种具有高抗严重影响花生产量的主要病虫害的优良基因,花生区组二倍体野生种A.correntina对锈病、斑驳病毒病、PStV、蓟马、蚜虫、叶蝉、螨虫、玉米螟等多种病虫害也具有抗性.19份由珍珠豆型农家品种贺粤1号与A.correntina经可育性杂交获得三倍体F1代,F1代再经过人工染色体加倍、回交和多代自交选择,形成的能稳定遗传且性状优良的四倍体新品系,4份栽培品种和野生亲本A.correntina共24份材料用于SSR分析,40对SSR引物中有3对引物PM36、PM50、PM305,能在部分杂种后代（PM36：T60;PM50：J17、J20、J22;PM350：J7、S11、T62）中稳定地扩增出野生亲本的特异谱带,表明这些材料整合了野生亲本的遗传物质.SSR特异谱带可以作为这几份材料中野生亲本A.correntina的特异遗传标记.此外,有两对引物PM36、PM106能在一些杂种后代中扩增出父母本没有的DNA条带,使SSR分子标记表现出非共显性.     

两种凝胶电泳系统对SSR标记多态性的影响

利用 35个SSR引物和 14个玉米自交系直接比较了 3%Metaphor琼脂糖凝胶和 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳对SSR位点多态性水平的影响。结果表明 ,两种凝胶系统检测出的等位基因数目和基因多态性水平存在显著差异 ,12 %聚丙烯酰胺凝胶在区分微小差异片段能力上明显高于 3%Metaphor琼脂糖凝胶。另一方面在两种电泳检测系统下 ,14个自交系之间的遗传相似系数相关性 (r =0 516)达到了极显著水平 (P <0 0 1)。在 10个具有最大多态性信息量的SSR引物中 ,8个在两种凝胶系统中保持相同。利用 8个引物可以对供试自交系进行初步鉴定。笔者认为 ,3%Metaphor琼脂糖凝胶电泳比较适合在遗传作图或基因定位研究中应用 ;而在品种指纹图谱分析或遗传多样性研究中 ,应采用 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测工具     

利用SSR标记分析24份玉米种质亲缘关系

利用SSR标记研究了从非洲收集的24份玉米种质的遗传多样性及类群划分。用25对扩增带型稳定的引物,从供试材料中共检测出153个等位基因变异,每对引物检测出0~17个等位基因,平均6.12个。24份供试种质的遗传相似系数变化范围在0.44~1之间,平均为0.69。按UPGMA方法进行聚类分析,可将其分为4大类群,其中7号可能属于新的杂优类群。     

利用SSR标记辅助选择杂交组合亲本

本研究利用60对SSR引物对籼稻品种佳辐占与6个候选亲本品种进行相互之间的多态性分析。结果表明：佳辐占与明恢63之间的多态性程度最高，达到22．7％；其次是与明恢86之间的多态性程度，达19．6％，而与其他品种的多态性程度较低。多态性程度高的品种间的杂交组合，其杂种优势明显高于多态性程度低的品种间的组合。初步表明，根据SSR多态性程度的高低选配亲本，其配制杂交组合可以获得较高的杂种优势。     

水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析

为评价插入缺失（InDel）标记在水稻分子育种中的应用价值,本研究用日本晴和9311序列筛选得到遍布每条染色体的20对InDel标记和53对SSR标记,分析46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。研究表明这些InDel标记在籼粳亚种间具有很高的多态性,亚种内多态性较低,平均多态性水平显著小于SSR标记,InDel标记具有数量多,扩增产物稳定和易于检测等优点,将InDel标记应用到遗传图谱构建、基因定位分析和标记辅助选择中可以加速研究进程。     

利用新开发的SSR标记分析花生栽培种的多态性

采用12份花生栽培种材料,对通过建库、筛库、杂交富集的策略开发设计出来123对SSR引物进行评估,并基于品种间简单匹配系数进行聚类分析。研究表明有44对SSR引物能产生多态性片段,总共获得176条带,其中107条（60.8%）为多态性带。平均每对引物产生4条带,2.43条为多态性带,多态性条带的比率为11.1%~100%,PIC值为0.245~0.886,平均为0.677;根据聚类结果显示,在简单匹配系数值为0.85处,根据SSR带型12个花生品种可分成3个品种群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。研究结果表明,新开发的44对SSR引物在分析花生栽培种DNA多态性方面非常有用。     

花生SSR标记与农艺性状的相关性

以农家品种四粒红和冀农黑3号构建的包含有251个家系的重组自交系(RIL)群体为材料, 在保定市和邯郸大名县两地进行表型鉴定, 利用Pearson’s相关和逐步多元回归分析了花生农艺性状之间及其与标记的相关性。结果表明, 多数农艺性状间存在显著或极显著相关, 其中相关性最高的为单株生产力和单株仁重(r=0.970), 其次是主茎高和第一侧枝长(r=0.918); 77对SSR标记与18个农艺性状显著相关, 每个性状相关标记数在2~16之间; 14个SSR标记与13个农艺性状关联, 解释的表型变异为5.2%~11.5%。以上结果为今后花生的常规育种和分子标记辅助选择奠定了基础。     

河南省审定花生品种的指纹图谱构建

利用14个SSR标记构建了河南省2015年之前选育并审定的90个花生品种的DNA指纹图谱,用14个SSR标记产生的95个多态性位点可将90个花生品种完全区分开,其中84个品种间有≥2个位点的差异,在剩余的3对品种中,每对仅有1个差异位点。聚类分析结果表明,在遗传相似系数0.98处,90个花生品种被聚集成88类,有2对品种分别聚集在一起,是由于它们每一个品种分别以另一个品种作亲本选育而成,仅有1个差异SSR位点,表明所构建的指纹图谱是有效的。以遗传相似系数0.95为划分标准,有74.4%的品种具有特异性,与其他作物相比,河南省育成花生品种总体上亲缘关系相对较近。根据60个SSR标记的群体结构分析,90个花生品种可以分为3个亚群,与根据分枝开花习性和荚果类型的分类相吻合,亚群划分情况与聚类分析结果基本一致。     

花生EST-SSR分子标记的开发

利用NCBI的Genbank数据库中公布的花生53177条EST序列以及本实验室创造的花生栽培品种E12(Arachis hypogaea L.)所构建的Unigene文库中的4 074条EST序列,对这些序列进行前期处理(去除冗余序列,对含有重叠区域的EST序列进行拼接),总共获得非冗余且拼接较长的序列11 260条.通过软件分析发现两个EST库中共包含有1 323个SSR位点,主要是2个和3个核苷酸重复,除此之外也有少量的4核苷酸重复以及复合重复.这些EST-SSR平均长度为18.88 bp,平均每8.5条EST序列就包含有一个SSR位点.其中AG/TC、CTY/GAA重复出现的频率最大,分别占到2个核苷酸重复和3个核苷酸重复的39.3%和22.6%.     

利用SSR快速鉴别花生杂交F1真伪

本研究,我们以6个花生品种为亲本配置杂交组合,田间调查发现亲本间形态表型差异大的杂交F1容易鉴别真伪,而形态表型差异小的则难于鉴别,甚至无法鉴别。为此,我们通过改良Thomson一步法制备DNA模板,建立了一套花生SSR-PCR快速检测体系,并在此基础上利用SSR鉴别花生杂交F1真伪。结果表明,采用Thomson一步法和改良后的一步法提取的DNA模版均能扩展出清晰条带,但改良后制备的DNA模板在4℃下可保存约1个月,未改良的仅能保存一天。利用SSR检测上述群体表明,F1真杂种率为38%～56%,不同亲本间杂交成功率存在差异,同一亲本正反交成功率也存在一定差异。可见,SSR标记用于杂种真伪鉴定具有一定的应用潜力。     

花生栽培种(Arachis hypogaea)类型间遗传差异的SSR分析

本文采用110对SSR引物分析28份花生栽培种资源(7份多粒型、5份龙生型、8份普通型和8份珍珠豆型)间的遗传差异,其中有46对引物在不同品种间检测出2～9个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.080～0.869.对28份材料的聚类分析表明,SSR聚类结果与根据形态特征的分类结果基本一致,但在多粒型品种上存在一定差异.标记pPGSseq15C12在本研究中所有的珍珠豆型品种上均扩增出特异性条带,序列分析表明该标记在珍珠豆型与其它类型间扩增片段的差异是由于ATT重复次数不同所致.     

SSR标记与花生抗黄曲霉性状的关联分析

本文选用100对SSR引物对12个抗感黄曲霉花生品种的基因组DNA进行扩增,结果表明共有41对引物在不同品种间检测出2～4个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.153～0.750.供试品种SSR标记基因型与黄曲霉侵染指数间的关联分析表明有5个标记与抗性相关,其中标记pPGSseq19D9与抗性关联度最高,Pearson相关系数达0.913.进一步观察发现pPGSseq19D9的扩增带型能直接区分抗感品种,初步推断pPGSseq19D9可能与一个贡献率较大的抗黄曲霉基因连锁.     

NCBI和cDNA文库中栽培花生EST-SSR分子标记的开发及其特点

本研究利用NCBI的GenBank数据库中公布的花生86 132条EST序列以及利用高油酸品种E12所创建的cDNA文库中的12 501条EST序列,对这些序列进行前期处理,总共获得非冗余且拼接较长的singleton 11 260条,contig 9 972条.通过MISA软件分析发现两个EST库中共包含有3 104个SSR位点,占到总共非冗余序列的11.08%.这些SSR位点被分成二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复以及混合核苷酸重复等,其中三核苷酸重复占的比例最多,分别占到NCBI和cDNA文库的43.0%和56.8%,二核苷酸和五核苷酸重复占到所有重复位点的第二位和第三位,六核苷酸重复的比例最少.在所有重复基序中,AG/TC重复的数量最多,分别占到NCBI和cDNA文库的8.65%和13.42%.在三核苷酸重复中,CTT/GAA出现的频率最大,分别占到6.7%和13.42%.所有这些SSR基序的长度在4～51个之间.     

花生栽培种EST-SSRs分布特征及应用研究

利用自行开发的20 160条花生栽培种荚果EST, 通过序列拼接, 获得8 289条无冗余EST。经搜索, 共检测出740个SSR位点, 分布于651条EST中, 发生频率为7.8%, 平均每6.8 kb EST序列含一个SSR位点。功能注释结果表明具生物过程、分子功能和细胞组分的EST分别为73、111和56条。在花生荚果EST-SSR中, 三核苷酸重复类型出现频率最高, 占总SSR的62.8%, 其次是二核苷酸重复类型, 占总SSR的33.6%。在出现的26类重复基序中, AG/TC重复基序出现频率最高, AAG/TTC次之。利用Primer premier 5从651条含有SSR的EST中共设计引物233对, 从中随机选取100对引物检测EST-SSR在花生栽培种中的多态性及在野生种中的可转移性。结果表明, 有86对引物在供试的22个花生栽培品种中得到有效扩增, 其中10对在栽培种中具有多态性, 每对引物检测出的等位基因数2~3个, 平均2.2个。可扩增引物在野生种中的可转移率为12.5%~100%,平均96%。在野生种间检测出多态性的引物76对,每对引物检测出等位基因2~9个, 平均4.06个。