p21基因的saRNA表达质粒的构建及功能研究

目的构建可表达具有RNA激活功能的小激活RNA(saRNA)质粒表达载体,并对其激活前列腺癌细胞PC-3中p21WAF1/CIP1(p21)基因表达的功能进行相关研究。方法人工合成与p21基因启动子特定序列相应的DNA片段及同样长度的随机DNA序列,利用DNA重组技术将这些片段构建到真核小分子双链RNA(dsRNA)表达质粒pGenesil-1中,构建成能表达dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNAp21-pGenesil-1)和随机对照dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNACon-pGenesil-1)。采用脂质体介导方法,分别将dsRNAp21-pGenesil-1(实验组)、dsRNACon-pGenesil-1(随机对照组)及空白质粒pGenesil-1(空白对照组)转染到体外培养的PC-3细胞,通过荧光染色检测转染效率,采用RT-PCR和免疫组化技术检测各组细胞p21蛋白表达的差异。结果成功构建目的表达载体dsRNAp21-pGenesil-1及随机对照载体dsRNACon-pGenesil-1,将各组质粒转染到PC-3细胞后,实验组p21基因表达明显增强,而随机对照组和空白对照组无明显变化。结论本研究构建的dsRNA表达质粒载体能成功表达saRNA分子,并激活p21基因及蛋白的表达,为研究的激活效应提供有效工具。     

外源性p27KIP1基因对人胃癌细胞SGC7901的生物学效应

目的　研究外源性p2 7KIP1 基因对人胃癌细胞SGC790 1的生物学效应。方法　采用脂质体转染法将p2 7KIP1 全长cDNA转入胃癌细胞系SGC790 1中 ,通过免疫印迹分析以及RNA斑点杂交方法检测 p2 7KIP1 基因在蛋白质和mRNA水平的表达 ;用细胞活力实验显示转染 p2 7KIP1 基因对细胞增殖的作用 ;用裸鼠成瘤实验观察外源性 p2 7KIP1 基因对人胃癌细胞SGC790 1的体外生物学效应。结果　转染p2 7KIP1 的SGC790 1细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p2 7KIP1 的表达。细胞活力检测显示在外加Zn2 +48h后细胞生长被抑制 42 % ;转染p2 7KIP1 的SGC790 1细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显下降 (P <0 .0 1 )。结论　外源性p2 7KIP1 基因能抑制人胃癌细胞SGC790 1的生长及成瘤能力。     

P27KIP1和P53及P21WAF1/CIP1表达与胃癌临床病理及预后的关系

目的研究P27KIP1、P53、P21WAF1/CIP1蛋白表达与胃癌临床病理及预后的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测90例胃癌组织中P27KIP1、P53、P21WAF1/CIP1的表达。结果90例胃癌组织中P27KIP1、P53、P21WAF1/CIP1阳性表达率分别为48.9%、56.7%、51.1%;随肿瘤分化程度降低、浸润深度加深、恶性程度增加,P27KIP1、P21WAF1/CIP1阳性表达率逐渐降低(P<0.05),P53阳性表达则相反;P27KIP1与P53、P21WAF1/CIP1表达显著相关(P<0.05);P27KIP1、P21WAF1/CIP1表达与胃癌预后密切相关(P<0.05),P53表达与患者术后生存无显著相关(P>0.05)。结论P27KIP1、P53、P21WAF1/CIP1异常表达可加速细胞周期转化,促进胃癌的发生,其蛋白检测尤其是P27KIP1、P21WAF1/CIP1蛋白检测可作为判断胃癌恶性程度、预测肿瘤转移和预后的重要参考指标。     

小干扰RNA对胃癌细胞葡萄糖调节蛋白94表达的抑制作用

目的构建Grp94靶向RNA干扰质粒载体，观察其对人类胃癌细胞株SGC-7901 Grp94基因表达的抑制作用。方法从GenBank中选取人类Grp94基因序列，采用siRNA Target Designer-Version 1．51设计软件设计1对Grp94基因发卡寡核苷酸，序列符合siRNA表达载体siSTRIKE^TM U6的要求并与psiSTRIKE^TM质粒载体连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体。采用Lipofectamne^TM 2000转染试剂进行转染，将重组质粒导入人类胃癌细胞株SGC-7901内，分别在转染前、转染后24、48和72h通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫荧光技术检测Grp94 mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建RNA干扰质粒载体，靶向Grp94干扰质粒载体命名为psiSTRIKE^TM／Grp94，将上述质粒转染到人类胃癌细胞株后，观察到psiSTRIKE^TM／Grp94能够明显下调Grp94 mRNA及蛋白水平的表达，并随着时间推移稳定存在。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKE^TM／Grp94能明显抑制Grp94 mRNA及蛋白的表达，提示通过降低胃癌细胞中Grp94的表达，可能抑制或辅助抑制胃癌细胞的生长的作用。     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞血管内皮生长因子C表达的实验研究

目的 构建针对血管内皮生长因子C（VEGF-C）的RNA干扰质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP,并评价其转染胃癌细胞后对VEGF-C表达的抑制作用.方法 设计并合成针对VEGF-C基因mRNA序列的3条短发夹RNA及1条阴性对照序列,克隆到pSIH1-H1-copGFP载体,重组构建RNA干扰质粒,并将其转染胃癌细胞（SGC7901）,采用RT-PCR分析转染后VEGF-C基因的表达情况.结果 重组构建pSIH1-H1-copGFP载体经双酶切及插入片断序列分析,表明其成功插入设计位点,并且序列完全一致.3种siRNA质粒表达载体的转染效率均为60%～70%,对VEGF-C mRNA表达的抑制率分别为35.4%、33.8%和81.5%.结论 RNA干扰质粒表达载体介导对VEGF-C基因的RNA干扰可明显抑制胃癌细胞中VEGF-C的表达,可能成为抑制胃癌淋巴管生成的一种有效手段.     

人肠凝集素-1真核表达载体的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的 构建人肠凝集素-1( ITLN-1)基因的真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增ITLN-1 cDNA,定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1,测序鉴定;在脂质体的介导下,重组质粒瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901 72 h后,Western blot法检测细胞培养上清中ITLN-1表达,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法、Transwell小室实验检测癌细胞增殖、侵袭活性.结果 真核表达载体pEGFP-ITLN-1转染SGC-7901细胞72 h后,ITLN-1 蛋白表达上调5.72倍(P＜0.01),细胞增殖活性降低52.8％ (P＜ 0.01),细胞侵袭能力下调58.1％ (P＜0.01).结论 成功构建人ITLN-1真核表达载体,转染胃癌细胞过表达后,能抑制癌细胞的增殖和侵袭活性.     

p21saRNA真核表达质粒的构建及其在泌尿系肿瘤细胞中的功能

目的 构建可表达具有RNA激活功能的小分子双链RNA(dsRNA)真核表达质粒,并探讨其调控前列腺癌细胞株PC-3和膀胱癌细胞株T-24中抑癌基因p21 WAF1/CIP1表达的功能.方法 构建真核表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1,并分别转染至PC-3和T-24细胞株,通过实时定量聚合酶链反应( Real-time qPCR)和Western blot检测p21mRNA转录水平和蛋白表达的变化.结果 测序结果证实目的表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1构建成功,将其转染入PC-3细胞和T-24细胞中,Real-time qPCR检测p21基因分别被上调4.35倍和2.83倍,Western blot进一步证明在两种细胞株中p21蛋白表达水平的增加与p21mRNA水平的上调一致,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的dsRNAP21-pGenesil-1质粒具备在泌尿系肿瘤中上调抑癌基因p21表达的能力.     

过表达的p27KIP1基因诱导HCC-9204细胞凋亡

目的：研究P27KIP1基因对肝癌细胞凋亡的潜在调节作用。方法：采用一种可诱导性真核表达载体pMD-neo，通过外加Zn离子诱导目的基因的表达，脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入肝癌细胞系HCC－9204中，通过免疫组化及RT－PCR检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，流式细胞仪，TUNEL染色及透射电镜等方法观察目的基因对该细胞凋亡的影响，结果：转染P27KIP1的HCC－9204细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平P27KIP1的表达，P27KIP1的过表达使G1期前出现一个亚二倍体的凋亡峰，占20％，并且其凋亡指数也显著增加（P＜0．01），结论：P27KIP1基因能够诱导HCC－9204细胞凋亡。     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

p33ING1b真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建pCDNA3/p33ING1b真核表达质粒并探讨其对肝癌细胞SMMU7721生长的抑制作用.方法将p33ING1b cDNA正反义亚克隆至pCDNA3真核表达载体上,并经磷酸钙共沉淀法分别转染至SMMU7721细胞中.转染后48h,用0.8g/LG418筛选出阳性克隆,检测转染后细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率的变化及应用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变.结果重组pCDNA3/p33ING1b正反义表达质粒构建成功.经正义p33ING1b质粒转染的SMMU7721细胞生长速度减慢,快速增长期比对照组推迟2d,软琼脂克隆形成率为(69.0±12.0)‰,较转染空载体(90.0±10.5)‰及反义表达质粒(149.0±15.0)‰的SMMU7721细胞减少,细胞凋亡率(22.53%)亦比空载体组(8.95%)及反义组(7.75%)上升.结论重组pCDNA3/p33ING1b质粒能在SMMU7721细胞内表达,且能抑制SMMU7721细胞的生长并促进其凋亡.     

腺病毒载体介导的早幼粒细胞白血病基因生长抑制因子诱导胃癌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨腺病毒载体介导的早幼粒细胞白血病基因（PML）生长抑制因子诱导胃癌细胞凋亡作用的机制。方法 将人PML全长cDNA插入穿梭质粒pSGCMV，再与腺病毒骨架质粒pPE3共转染293细胞后获得重组病毒。用重组病毒感染胃癌细胞系SGC-7901，采用噻唑蓝比色法、流式细胞术以及免疫细胞化学法对p53和bcl-2在肿瘤细胞内的表达以及细胞凋亡的定性与定量指标进行检测。结果 经腺病毒介导的PML处理的SGC-7901细胞生长受到明显抑制，凋亡细胞发生率升高，且与MOI值呈正相关，MOI值由5增加到20，细胞的生长抑制率从22．4％增加到38．5％，而细胞凋亡率从37．2％增加到49．8％。经腺病毒介导的PML处理的SGC-7901细胞内p53蛋白表达较对照组明显增加，bel-2蛋白的表达则无明显变化。结论 腺病毒介导的PML对胃癌细胞的杀伤主要是通过诱导细胞凋亡，p53蛋白高表达为其诱发胃癌细胞凋亡的机制之一。     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

抑癌基因WTX对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的:探讨WTX基因对人胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响。方法:将WTX重组质粒或空载体质粒用Attractene法转染SGC-7901细胞,以无处理SGC-7901细胞为空白对照,检测不同时间e GFP标记的转染效率;RT-PCR法检测WTX m RNA水平;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞技术检测转染效率、凋亡及细胞周期的变化。结果:转染WTX基因48 h后,e GFP表达最强,转染效率达(33.10±4.16)%;与空白对照组和空载体组比较,WTX转染组WTX m RNA表达明显升高;细胞增殖能力明显降低,S期细胞明显增多,而G1期和G2/M期细胞减少(均P<0.05)。各组细胞均未见明显的细胞凋亡。结论:WTX可通过诱导S期阻滞抑制胃癌细胞SGC-7901生长,但不影响细胞凋亡。     

Dapper1在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控

目的 研究Dapper1(Dpr1)在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控.方法 用RT-PCR方法检测30例患者胃癌及癌旁正常组织中Dpr1 mRNA的表达情况;用RT-PCR检测SGC7901细胞转染pcDNA3.1-Dpr1质粒前后Dpr1和survivin mRNA表达的变化;用Western blot检测转染前后Dvl-2、β-catenin及survivin蛋白表达的变化;用流式细胞术检测转染后SGC7901细胞凋亡率的变化. 结果本组30例胃癌组织中17例Dapperl mRNA表达下调,发生率为57%,且与胃癌的浸润深度和分化程度相关(P＜0.05);转染pcDNA3.1-Dpr1后SGC7901细胞中Dpr1 mRNA表达水平上调,survivin mRNA表达水平下调;Dvl-2、β-catenin以及Survivin蛋白表达量降低;转染pcDNA3.1-Dpr1质粒后SGC7901细胞的凋亡率升高. 结论 Dpr1能够通过经典WNT通路抑制凋亡相关蛋白survivin的表达,在胃癌细胞的凋亡中发挥重要作用.     

LncRNA C21orF96通过调控miR-875-5p和USF2基因表达促进胃癌细胞的侵袭和转移

目的探讨lncRNA-C21orF96调控miRNA-875-5p和USF2基因表达促进胃癌细胞的侵袭和转移机制。方法采用RT-PCR技术检测胃癌细胞中与lncRNA-C21orF96相关的m iRNA的含量;胃癌细胞KATO-Ⅲ经pcDNA3.1质粒过表达lncRNA-C21orF96,SGC-7901细胞经siRNA干扰lncRNA-C21orF96表达后,采用R T-PCR技术检测胃癌细胞中miR-875-5p和USF2基因表达量的变化;胃癌细胞MKN45过表达lncRNA-C21orF96后,采用Transwell实验观察细胞侵袭和迁移能力的变化。结果在胃癌细胞中,lncRNA-C21orF96与miR-875-5P值呈显著的相反关系,两者之间相对定量值差异具有统计学意义(SGC-7901细胞:21.19±1.09比3.28±0.06,P<0.01;SNU-16细胞:24.76±2.09比8.16±0.07,P<0.01);转染lncRNA-C21orF96表达载体的KATO-Ⅲ细胞中miR-875-5p表达显著下降而USF2基因表达升高(0<0.01);转染lncRNA-C21orF96干扰载体的SGC-7901细胞中miR-875-5p表达显著升高而USF2基因表达降低(P<0.05);lncRNA-C21orF96过表达后,实验组穿过人工基底膜的平均细胞数与对照组相比差异具有统计学意义[迁移实验:(216.19±2.30)个比(89.19±4.60)个,P<0.001;侵袭实验:(146.18±5.3)个比(59.18±2.60)个,P<0.001]。结论lncRNA-C21orF96的过表达能显著调控miR-875-5p表达同时促进USF2基因表达,促进胃癌细胞的侵袭和转移。     

Adp27KIP1基因的过度表达对人膀胱癌细胞系EJ的抑制作用

目的　探讨ｐ２７ＫＩＰ１ 的过度表达对人膀胱癌细胞系ＥＪ的影响。　方法　构建含人ｐ２７ＫＩＰ１ 基因的重组缺陷腺病毒,并感染ＥＪ细胞,７２ 小时后检测ｐ２７ＫＩＰ１ 蛋白的表达、生长曲线、克隆形成率和细胞周期分布。　结果　转基因后,ＥＪ细胞过度表达ｐ２７ＫＩＰ１ 蛋白,增殖明显受阻,细胞停滞于Ｇ１ 期。　结论　ｐ２７ＫＩＰ１ 的过度表达可明显抑制ＥＪ细胞的增殖,提示ｐ２７ＫＩＰ１ 基因在人膀胱癌的发生中起重要作用,用重组腺病毒转ｐ２７ＫＩＰ１ 基因可成为潜在的膀胱癌治疗方法。