乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者RORγt mRNA表达的研究

目的研究乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者外周血单个核细胞Th17细胞特异转录因子———RORγt的mRNA表达。方法采用实时定量RT-PCR测定乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者外周血单个核细胞RORγt基因mRNA表达。结果健康对照组外周血单个核细胞RORγt mRNA表达为0.31±0.13,乙型肝炎组为1.23±0.25,肝硬化组为1.36±0.21,肝癌组为1.42±0.27。乙型肝炎、肝硬化和肝癌组外周血单个核细胞RORγt mRNA表达与健康对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者外周血单个核细胞RORγt mRNA表达升高,RORγt在乙型肝炎、肝硬化和肝癌的发病中具有重要的作用。     

细胞周期抑制蛋白p16INK4a在喉鳞状上皮病变中的异常表达

目的探讨喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生及喉慢性炎中p16INK4a蛋白表达水平的变化及意义。方法应用免疫组化方法检测86例喉鳞状上皮病变（喉鳞状细胞癌16例、喉上皮不典型增生48例,喉慢性炎22例）组织中p16INK4a蛋白的表达,进行半定量分析及统计学检验。结果16例喉鳞状细胞癌中,p16INK4a全部阳性表达;48例喉上皮内瘤变中,35例p16INK4a阳性表达,阳性率为72．92％,其中轻度不典型增生,中度不典型增生,重度不典型增生p16INK4a阳性表达率分别是33．3％（4／12）、75％（15／20）、100％（16／16）,且三者间差异有统计学意义（P〈0．05）。22例喉慢性炎中,p16INK4a阳性表达6例,阳性表达率为27．27％。p16INK4a阳性蛋白在喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生及喉慢性炎组织中表达水平依次降低,且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生中p16INK4a阳性表达明显高于喉慢性炎。p16INK4a在喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生中过表达,提示其在喉鳞状细胞癌、喉鳞状上皮不典型增生发生发展中起重要作用。     

p15INK4B甲基化与骨髓增生异常综合征患者预后及地西他滨疗效的关系

目的 通过检测初诊骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15INK4B甲基化水平,观察地西他滨治疗前、后p15INK4B甲基化状态变化,探讨p15INK4B甲基化水平与预后的关系及其对地西他滨疗效的影响.方法 261例初诊MDS患者,其中男143例,女118例,中位年龄52(32 ～78)岁.低危组172例(低危104例、中危-1 68例),高危组89例(中危-2 52例、高危37例).收集患者骨髓单个核细胞,采用甲基化特异性PCR (MSP)检测p15INK4B甲基化水平,按p15INK4B甲基化程度对患者进行生存分析.采用MSP方法分别检测58例MDS患者地西他滨治疗前及治疗2个疗程后骨髓p15INK4B甲基化水平,分析p15INK4B甲基化对地西他滨疗效的影响.结果 低危组患者p15INK4B甲基化水平明显低于高危组患者(117.22对157.63,P＜0.05).p15INK4B甲基化阳性患者2年预期生存(OS)率低于阴性患者(69.8％对91.8％,P＜0.05);在低危组,p15INK4B甲基化阳性患者2年预期OS率低于阴性患者(78.2％对92.0％,P＜0.05);在高危组,p15INK4B甲基化阳性患者OS率及中位OS时间与阴性患者比较差异无统计学意义[35.6％对38.5％,(17.0±9.3)个月对(18.0±5.7)个月,P＞0.05].COX分析结果显示p15INK4B甲基化水平是OS时间的独立预后因素.治疗前p15INK4B甲基化阳性组患者地西他滨治疗的总反应率及完全缓解率与阴性组比较差异无统计学意义(65.9％对76.5％,22.0％对29.4％,P＞0.05).地西他滨治疗有效组p15INK4B甲基化水平在治疗前、后差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初诊时p15INK4B甲基化水平高的MDS患者生存时间更短,但p15INK4B甲基化水平对地西他滨疗效无明显影响.     

p16INK4a、p19ARF、p15INK4b基因及其在急性T淋巴细胞白血病中的研究进展

p16INK4a、p19ARF、p15INK4b基因是位于染色体9p21的相邻基因.它们均为肿瘤抑制基因,但是它们的肿瘤抑制机理各不相同.已发现在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中其失活率很高.且它们的失活与T细胞的TCR重排有关.本文对近年来p16INK4a、p19ARF、p15INK4b结构与功能及其在T-ALL中的改变的研究进展作一综述,以阐明它们对T-AlL的发生与发展有极其重要的作用.     

HLA-GmRNA在肝癌患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的：了解肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMC）、人类白细胞抗原 G mRNA（HLA-G mRNA）的表达水平及其意义。方法收集44例 HCC患者、21例肝硬化患者和40例健康查体者的 PBMC,建立逆转录-实时荧光 PCR相对定量体系检测PBMC HLA-G mRNA相对表达量。结果 HCC组、肝硬化组和健康对照组的 HLA-G mRNA相对表达量分别为1.71±0.39,1.05±0.38和1.01±0.47,HCC组高于肝硬化组和对照组,差异有统计学意义（F＝33.657,P＜0.001）。HLA-G mRNA高表达的 HCC患者生存率低于 HLA-G mRNA低表达者,差异有统计学意义（χ2＝5.972,P＝0.015）。结论 PBMC HLA-G mRNA相对表达量与肝癌发生发展密切相关,检测 PBMC HLA-G mRNA有助于肝癌的诊断与研究。     

p16^INK4A蛋白表达在子宫颈腺癌早期诊断中的作用

目的：研究p16INK4A蛋白在宫颈腺癌及其癌前病变早期诊断中的作用。方法：共选取58例病理蜡块组织,其中包括正常宫颈上皮20例、宫颈腺上皮内瘤变（癌前病变）6例和宫颈腺癌32例。应用免疫组化EnVision法检测p16INK4A蛋白在上述组织中的表达情况,并分析p16INK4A蛋白检测的临床病理学意义。结果：20例正常宫颈上皮均表现为p16INK4A蛋白阴性,在6例宫颈腺上皮瘤变组织中仅1例表现为p16INK4A蛋白阴性,其它5例均为强阳性,阳性率为83.3%,在32例宫颈腺癌中仅2例为阴性,其它病例也均表现为强阳性（阳性率93.8%）。结论：p16INK4A蛋白检测可作为宫颈腺癌及其癌前病变的早期诊断指标。     

惠州龙门地区妇女宫颈病变中p16INK4a蛋白与KGFR的表达及意义

目的探讨p16INK4a蛋白、角质细胞生长因子受体(KGFR)在惠州龙门地区妇女宫颈病变中的表达及意义。方法选取2013年6月至2014年6月于惠州市龙门人民医院就诊的180例妇女,按照病例诊断结果将所有研究对象分为宫颈鳞癌组(40例),宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ/Ⅲ组(45例),CINⅠ组(48例),健康及慢性炎症组(47例)。采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结(SP)法对p16INK4a蛋白及KGFR的表达进行检测,并比较分析不同病理分期的表达差异。结果宫颈鳞癌组、CINⅡ/Ⅲ组、CINⅠ组、健康及慢性炎症组的p16INK4a蛋白表达阳性率分别为90.0%、82.2%、29.2%、0.0%,KGFR表达阳性率分别为87.5%、84.4%、52.1%、42.6%。p16INK4a蛋白与KGFR在宫颈组织中的表达随着病理分期的上升而增加,组间p16INK4a蛋白及KGFR表达阳性率比较差异均有统计学意义(P0.01)。结论惠州龙门地区妇女宫颈病变中p16INK4a蛋白、KGFR均有不同程度的表达,且与宫颈病变进展密切相关。     

5′-杂氮-2′-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨 5′ 杂氮 2′ 脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 Aza CdR ,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征 (MDS)细胞体外作用的机制。以人MDS RAEB细胞株MUTZ 1细胞为研究对象 ,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率 ;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸 (PS)转位及细胞凋亡 ;用RT PCR检测 p15INK4B基因、甲基转移酶 (DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达 ;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测 p15INK4B基因甲基化程度。结果表明 :5 Aza CdR对MUTZ 1细胞有生长抑制作用 ;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变。p15INK4B基因甲基化程度随 5 Aza CdR剂量增加而减弱 ,伴随 p15INK4B基因mRNA表达增加。经 3.2mmol/L 5 Aza CdR作用 4 8小时后 ,MUTZ 1细胞DNMT3A mRNA表达水平较未加药组明显下降 (灰度比为 0 .385∶0 .6 5 4 ,P <0 .0 5 ) ,DNMT1、DNMT3B mRNA表达水平与未加药组相比无明显改变。结论 :在 0 .4 - 6 .4mmol/L浓度范围 5 Aza CdR通过诱导MUTZ 1细胞凋亡而抑制该细胞生长 ,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一。 5 Aza CdR可能通过下调DNMT3A mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降 ,从而恢复其表达。     

5''''-杂氮-2''''-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨5'-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞体外作用的机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)转位及细胞凋亡;用RT-PCR检测p15INK4B基因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测p15INK4B基因甲基化程度.结果表明5-Aza-CdR对MUTZ-1细胞有生长抑制作用;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变.p15INK4B基因甲基化程度随5-Aza-CdR剂量增加而减弱,伴随p15INK4B基因mRNA表达增加.经3.2mmol/L 5-Aza-CdR作用48小时后,MUTZ-1细胞DNMT3AmRNA表达水平较未加药组明显下降(灰度比为0.3850.654,P＜0.05),DNMT1、DNMT3BmRNA表达水平与未药组相比无明显改变.结论在0.4-6.4 mmol/L浓度范围5-Aza-CdR通过诱导MUTZ-1细胞凋亡而抑制该细胞生长,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一.5-Aza-CdR可能通过下调DNMT3AmRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,从而恢复其表达.     

乙型病毒性肝炎肝硬化、原发性肝癌患者外周血调节性B细胞检测

目的检测乙肝肝硬化、原发性肝癌患者外周血调节性B细胞（Breg）的比率,了解Breg与肝硬化、肝癌疾病之间的关系。方法以CD19^＋CD5^＋CD1d^＋作为Breg标记,流式细胞术检测24例乙肝肝硬化患者、28例肝癌患者和20名健康对照者外周血Breg占B淋巴细胞的比率。结果肝硬化患者组Breg比率（29.90±9.19）%和肝癌患者组Breg比率（31.34±8.99）%均显著高于健康对照组（22.50±6.52）%,分别为P=0.016和P=0.003;肝硬化患者组和肝癌患者组间Breg比率无统计学意义（P〉0.05）。结论与对照组比较,Breg比率在肝硬化、肝癌患者外周血中显著升高,提示Breg细胞增加,与肝硬化、肝癌B细胞免疫调节紊乱相关。     

喉鳞状细胞癌中p16INK4a基因甲基化状况及表达

目的研究喉鳞状细胞癌p16^（INK4a）基因启动子区域5′CpG岛的甲基化状况,探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床病理指标的关系。方法采用甲基化特异性PCR检测30例喉鳞状细胞癌及15例远离肿瘤的正常喉黏膜中p16^（INK4a）基因启动子区域5′CpG岛的甲基化状况,并应用免疫组化EnVision法检测p16^（INK4a）蛋白的表达情况。结果30例喉鳞状细胞癌中p16^（INK4a）基因启动子区5′CpG岛甲基化率76.7%（23/30）;p16^（INK4a）蛋白缺失率为93.3%（28/30）。15例正常喉黏膜中未检测到p16^（INK4a）基因异常甲基化,而且其相应蛋白表达均为阳性。p16^（INK4a）基因甲基化状况与其蛋白表达和临床分期密切相关。结论p16^（INK4a）基因5′CpG岛异常甲基化在喉鳞状细胞癌中频率很高,可能在喉癌发生、发展中扮演重要角色;而且这可能是一个早期事件,其临床早期诊断和基因治疗意义均值得进一步深入探讨。     

酶联免疫吸附法检测宫颈脱落细胞p16INK4a蛋白

目的 检测宫颈脱落细胞中p16INK4a蛋白,试图建立一种新的宫颈癌筛查方法 .方法 选取同时行液基细胞学(TCT)检查和宫颈组织活检的标本1356例.在进行活检之前所有标本用棉签拭子获取新鲜的宫颈脱落细胞,并用细胞刷取材行TCT检测.用ELISA方法 检测棉签拭子获取细胞及TCT保存液固定的宫颈脱落细胞中的p16INK4a蛋白的表达.结果 TCT方法 用于筛查宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的敏感性和特异性分别为82.93%和88.11%:ELISA方法 检测新鲜宫颈脱落细胞中的p16INK4a表达用于筛查的敏感性和特异性分别为87.80%和92.43%,其敏感性和特异性均优于TCT检查(P=0.023和P<0.001),ELISA检测p16INK4a蛋白的阳性率与宫颈病变程度呈正相关(r=0.774,P<0.001).结论 ELISA检测宫颈脱落细胞中p16INK4a表达用于筛查宫颈癌及CIN,其敏感性较高,特异性较强,有望成为一种新的宫颈癌筛查方法 .     

多发性骨髓瘤中p15^INK4B和p16^INK4A基因高基化的检测

为探索ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ和ｐ１６＾ＩＮＫ４Ａ基因的多发性骨随瘤中的甲基化的表达,采用敏感的甲基化特异的ＭＳＰ－ＰＣＲ测定方法,检测了２４例多发性骨髓瘤（ＭＭ）ｐ１５＾ＩＮＫ４Ａ基因甲基化的情况。结果显示,ＭＭ中ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ和ｐ１６＾ＩＮＫ４Ａ基因甲基化发生率分别为７０．８％（１７／２４）和５８．３％（１４／２４）,产物分别为１４８ｂｐ和１５０ｂｐ的片段,其中２例ＩＩ期和２例ＩＩＩ期的有浆细胞瘤的ＭＭ患发生２个基因同时甲基化,有５例２个基因都滑有发生甲基化,这５例的瘤分化较成熟的小浆细胞。结论提示,ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ和ｐ１６＾ＩＮＫ４Ａ基因甲基化在ＭＭ细胞中有一定的发生率,可能与ＭＭ发病机制有关。     

宫颈上皮内瘤变进展过程中p16INK4A和Claudin-1的表达及意义

目的:探讨p16INK4A和Claudin-1在宫颈上皮内瘤变(CIN)进展过程中的作用.方法:应用免疫组化二步法,检测正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中p16INK4A和Claudin-1蛋白的表达.结果:p16INK4A和Claudin-1蛋白阳性表达率及表达水平在各组间差异有统计学意义(P＜0.05),其表达水平及阳性率随疾病由低度鳞状上皮内病变(LSIL)向高度鳞状上皮内病变(HSIL)和浸润性鳞状细胞癌(ISCC)进展同步增强.p16INK4A与Claudin-1蛋白表达间无相关性(P＞0.05).结论:p16INK4A及Claudin-1与宫颈鳞状上皮的恶性转化相关;联合检测宫颈病变中p16INK4A和Claudin-1的表达,有助于早期诊断CIN和宫颈癌.     

p16^INK4a和Ki-67免疫细胞化学染色在宫颈液基细胞学中的应用价值

目的 探讨液基细胞学检测(LCT)剩余细胞学标本中p16INK4a、Ki-67的免疫细胞化学染色筛查宫颈鳞状细胞癌和宫颈癌前病变的价值.方法 采用免疫细胞化学和免疫组化法对194例细胞学标本和91例组织活检标本进行p16INK4a、Ki-67检测.结果 p16INK4a、Ki-67表达阳性率随着宫颈病变程度的加重而升高,与病变级别呈正相关.Ki-67的标记指数(LI)在HSIL组最高,与其他各组间均数的差异显著(P＜0.05).LSIL及其以上病变细胞学p16INK4a和Ki-67与组织学诊断符合率分别为87.3％和80.95%.宫颈脱落细胞学Ki-67、p16INK4a的免疫细胞化学染色检出高级别病变及鳞癌病变的敏感度、特异度分别为83.6％、86.7％和87.1％、100％. 结论 利用LCT液基细胞学涂片中p16INK4a、Ki-67的免疫细胞化学染色作为辅助诊断指标应用于宫颈癌高危人群筛查,具有重要意义.     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应对肿瘤细胞株p15基因甲基化或缺失状态的检测

本研究分析多种恶性肿瘤细胞株的p15基因甲基化或缺失状态,阐明p15基因甲基化或缺失在肿瘤发生发展中的作用。运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应(hemi-nested methylation specific polymerase chain reaction,hn-MSP)分析20种恶性肿瘤细胞株和正常人单个核细胞或细胞株的p15基因甲基化及缺失状态,并评价该方法的敏感性和特异性。结果表明:在所有的细胞中,Molt-4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC-7221、NCI-H446细胞为部分甲基化,hn-MSP检测p15基因甲基化敏感性可达到1×10-5。正常人单个核细胞、HL-60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、U266、CEM细胞则为p15非甲基化,而K562、NB4、GMC、Jurkat似乎显现p15基因缺失或突变。结论:p15基因甲基化或缺失在多种肿瘤,特别在恶性血液病中有较高的发生率,且对疾病的进展及预后有密切的关系,hn-MSP具有较高的敏感性和特异性,值得在临床推广应用。     

p15INK4b基因异常与骨髓增生异常综合征

在肿瘤抑制基因中，p15^INK4b基因由于在骨髓增生异常综合征（MDS）演进过程中的重要作用而逐渐受到关注，系列的研究表明，随着MDS向AML的演出一进，p15^INK4b基因由于其外显子1启动子区的5′CpG岛发生高度甲基化而失活，这种类型的甲基化限于MDS细胞克隆，用甲基化特异性PCR法可较为敏感地将其检测到，p15^INK4b基因的失活抑制了细胞因子如Fas抗原，TGF-β和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)蛋白介导的细胞凋亡，由于p15^INK4b基因甲基化与MDS的密切关系，调节基甲基化状态可能会成为治疗MDS的一个新途径。     

p15^INK4B基因甲基化在急性普细胞白血病和慢性粒细胞白血病中的研究

为探索ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在ＣｐＧ岛高甲基化对白血病发病机制的重要作用,应用敏感的甲基化特异的ＭＳＰ－ＰＣＲ的测定方法,测定了ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在急性粒细胞白血病（ＡＭＬ）和慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中甲基化的表达变化,研究结果表明,ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因操纵区在ＡＭＬ和ＣＭＬ中的甲基化发生率分别为８３．９％（２６／３１）和０％（０／２８）。结论提示：甲基化是ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因在ＡＭＬ中主要的失活方式之一,并可在病程进展中出现甲基化,使病情加重,在ＣＭＬ中无基化的发生,说明ｐ１５＾ＩＮＫ４Ｂ基因的功能在ＣＭＬ中可能是完整的。     

p19ARF和p16INK4a在人胰腺癌、结直肠癌中表达的比较研究

目的：比较p16^INK4a和p19^ARF2种抑癌基因在可切除的人胰腺癌和结直肠癌组织中的表达形式，从而对其在这两种肿瘤的发生、发展中的意义及两种肿瘤生物学行为差异的本质有一个初步认识。方法：胰腺癌和结直肠癌切除标本各30例的石蜡标本，用单克隆抗体免疫组化ABC法同时测定肿瘤组织的p16、p19和p21蛋白的表达。结果：胰腺癌的p16表达率13.3％(4/30)明显低于结直肠癌的40％(12/30，Pd0.02)；而p19在两者的表达率差异不明显。p16与p19表达无相关性。p16的表达率与胰腺癌的临床病理分期和分级呈负相关；有大血管浸润的胰腺癌p19阳性率(20％)低于无血管浸润者(72.2％,P=0.01)。P19在局部淋巴结阳性的胰腺癌表达率低于淋巴结阴性者，但无显著差异。而p16和p19与结直肠癌的病理分期、分级、血管浸润和淋巴结转移均无明显相关。结论：p16的下调是胰腺癌发生发展的一个重要原因，可能也是胰腺癌生物学行为明显不同于结直肠癌的主要原因；我们还首次发现p19下调与胰腺癌的大血管浸润和淋巴结转移有关，p19异常可能是胰腺癌播散的1种标示。未发现这2种抑癌基因与结直肠癌发生发展的明显关系。     

宫颈癌前病变和宫颈鳞状细胞癌中HPV16／18感染与P16INK4A表达的临床意义

目的探讨P16INK4A在宫颈鳞状细胞癌及癌前病变中的表达规律及其与人乳头状瘤病毒（HPV）感染之间的关系。方法采用免疫组织化学supervision二步法和原位杂交HPV16／18DNA检测,在60例慢性宫颈炎,58例宫颈低级别上皮内瘤变,62例高级别上皮内瘤变和62例宫颈鳞状细胞癌中的表达。结果P16INK4A在慢性宫颈炎中呈阴性,与宫颈低级别上皮内瘤变（阳性表达率为13．79％,8／58）之间差异无统计学意义（P〉0．05）。随着上皮病变级别升高,表达也逐渐增强,在宫颈鳞状细胞癌中表达更强;HPV16／18DNA在四组中阳性表达率,除高级别上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌两组间差异无统计学意义外（均为96．77％）,其余各组之间差异均有统计学意义（P〈0．01）;在宫颈低级别上皮内瘤变中P16INK4A蛋白表达和HPV感染相关无统计学意义,但在高级别上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌两组中均呈正相关（r高级别=0．373,r鳞癌=0．416,P〈0．05）。结论P16INK4A过表达及HPV16／18感染在宫颈鳞状细胞癌形成的中晚期起作用,提示两者均可作为一个早期诊断恶性病变的指标。