纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

纳豆激酶

纳豆激酶 (ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ)是一种枯草杆菌蛋白激酶 ,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ/ｎａｔｔｏ)产生的一种丝氨酸蛋白酶。 1 987年由日本的须见洋行等首先发现[1～ 3] 。研究发现 ,纳豆激酶具有纤溶活性 ,可治疗和预防血栓病 ,它还可激活体内的纤溶酶原 ,从而增加内源性纤溶酶的量与作用[4] 。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品 ,如链激酶 (ｓｔｒｅｐ ｔｏｋｉｎａｓｅ ,ＳＫ)、尿激酶 (ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ＵＫ)、重组组织型纤溶酶原激活剂 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ…     

纳豆激酶基因的表达及纯化

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到纳豆激酶基因(NK),利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体pETNK。在诱导下,实现了在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳分析和薄层扫描结果显示,表达的目的蛋白占菌体蛋白的21．5％。将表达产物经过DEAE-Cellulos-DE52和Sephedax-G100两个柱分离纯化,得到纯的纳豆激酶蛋白干粉,经琼脂糖-纤维蛋白平板法测出纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于200u尿激酶。从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础。     

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因,并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ,琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．     

纳豆激酶基因的优化设计、合成及其在烟草叶片中的瞬时表达

根据植物偏爱密码子优化设计、合成纳豆激酶基因sNK,利用重叠延伸PCR法在其中插入番茄果实特异性表达基因E8的第一内含子构成sNKi基因,通过农杆菌渗透法将这两种基因渗入到烟草NC89叶片中并实现瞬时表达。通过RT-qPCR法将两种基因在烟草叶片中转录水平的表达量进行比较,结果表明两种基因在烟草叶片中均表达,且sNKi基因的表达量显著高于sNK基因;通过纤维蛋白平板法在两种基因的瞬时表达样品中均能检测到纤溶酶活性,表明目的基因在烟草叶片中可正常翻译并表现出溶栓活性,且sNKi基因在翻译水平的表达量显著高于sNK基因。表明内含子对人工合成的纳豆激酶基因的瞬时表达具有显著的促进作用。     

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶,与传统的一些溶栓剂相比,其具有安全性好、成本低、口服有效等优点。就纳豆激酶的理化性质、制备过程、生物学功能、酶活测定方法及分子生物学研究等进行了综述。     

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌产生的具有强溶纤作用的碱性丝氨酸蛋白酶,具有安全性好、半衰期长、口服有效等优点.就纳豆激酶的结构、理化性质、功能、溶栓机制、酶活性测定、分离纯化以及纳豆激酶的应用现状及发展前景等方面进行了综述.     

纳豆激酶的分离纯化研究

从实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株出发,进行发酵产酶,确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺,主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化,用纤维蛋白平板法测定酶活力,用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,分子量为28kD。其有望开发为新型的口服溶栓药物。     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶是一种枯草芽孢杆菌产生的丝氨酸蛋白酶 ,具有强烈的纤溶活性 ,有望开发成为新型口服溶栓药。综述了纳豆激酶的生化特性、生物学活性、结构与功能及开发应用前景等。     

纳豆激酶的发酵工艺研究

以实验室选育的纳豆菌— 6号 (Bacillusnatto 6)为出发菌株 ,研究其固液两种发酵条件对纳豆激酶溶栓活力的影响。研究表明 ,纳豆菌适于固体发酵 ,37℃下 2 4h ,其活力可达 1 60 0IU/g以上。     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶的研究与应用付利,杨志兴（黑龙江省科学院应用微生物研究所）纳豆为日本的传统发酵大豆食品,已食用了２０００年以上。它是由枯草杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ）或纳豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏ）发酵大豆制造成的,日本民众十分喜欢食用。同时也被用作民间药品,以预防和治疗心脑血管性疾病。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究

实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达 ,并说明前肽 ( pro序列 )对纳豆激酶的活性表达必不可少。以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码信号肽、前肽及成熟肽的序列 ( pre pro NK)和编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建了大肠杆菌表达质粒 pTYB1 0 1 ,pTYB1 0 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 66。在IPTG诱导下 ,分别在 1 5℃ ( 1 4h) ,3 0℃ ( 3h)和 3 7℃ ( 2h)培养。结果可见 ,pTYB1 0 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,1 5℃表达杂蛋白更少。薄层扫描显示表达的纳豆激酶占菌体总蛋白的 3 0 %以上。成功制备了表达纳豆激酶的工程菌。     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆是日本的民间传统食品,1987年日本学者须见洋行从纳豆中分离提取和纯化出一种具有纤溶活性的蛋白激酶,称之为纳豆激酶(Nattokinase,NK)。它是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)经发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白的溶解时间,并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(Sumi H,1987年)。     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtillisnatto)分泌的一种具有纤溶作用的碱性丝氨酸蛋白酶。对纳豆激酶基因的克隆与表达,基因与蛋白质结构以及基因工程纳豆激酶的特性和功能进行了综述。     

草酸氧化酶基因转化烟草的研究

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV 35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。     

重组纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的直接溶解血纤维蛋白的特性,与当前的溶栓药物相比具有诸多优点,已成为新型溶栓药物开发的焦点。本文首先简要介绍了纳豆激酶基因及纳豆激酶分子的理化特性和生物学功能,对当前国内外采用基因工程技术（密码子优化、点突变、高效表达系统构建等）重组表达纳豆激酶的研究进展进行了综述,分析了其中存在的主要问题和不足以及商业化生产重组纳豆激酶的可能性,对纳豆激酶在医药、食品等行业中的应用前景进行了展望。     

纳豆激酶的研究现状与展望

纳豆激酶是从日本传统食品纳豆中提取的一种枯草杆菌蛋白酶,具有高效的抗血栓作用.与其他传统溶栓剂相比,纳豆激酶具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长等优点,因此极有可能开发为新一代的溶栓剂.概括了纳豆激酶的分子结构、理化性质、溶栓作用机理、活性检测方法,介绍了其分子生物学研究进展,并对其开发应用进行了展望,证明纳豆激酶具有广阔的市场应用前景.     

纳豆激酶发酵液的脱色工艺研究

从11种待选脱色介质中筛选出330(OH)型树脂对纳豆激酶发酵液进行脱色研究.结果表明:(1)330(OH)型树脂对纳豆激酶发酵液中的色素为优吸型吸附,其动力学模型符合扩散方程,其动力学拟和方程为-ln(1-F)=0.0223t+0.0511,R2=0.9978,其中F=Qt/Qe,Qt为脱色时间为t时330(OH)型...     

纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从发酵豆制品中分离筛选得到一株纳豆激酶高产菌株。利用该菌株以及市售的3种纳豆中的纳豆菌进行纳豆发酵,比较了4株纳豆菌发酵纳豆的特性,并对纳豆激酶活性进行分析。结果表明5号菌株发酵生产纳豆周期短,颜色金黄,具有酱香味,拉丝长度最佳。同时,对产纳豆激酶的最佳发酵时间进行研究,结果表明发酵至17 h纳豆激酶活性达到最大值。