登革病毒E蛋白基因表达载体的构建

利用高效表达载体pET系统，构建广东地区登革流行株E蛋白基因的高效表达载体，表达载体经酶切及测序鉴定表明载体构建正确。为探讨E蛋白在登革病毒致病机制中的作用。以及针对本地登革病毒高效、特异的单克隆抗体和高效价的特异高免血清的制备奠定了基础。     

LMW-GS16基因表达载体的构建

采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre／loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位．占、切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表达载体的构建

采用自行设计的带酶切位点的上下游引物,用ＰＣＲ技术,从大肠杆菌ＴＡＣＣ２３７４３的ＤＮＡ中,获得了含有编码尿嘧啶ＤＮＡ糖苷酶（ＵＮＧ）基因的ＰＣＲ产物,以该ＰＣＲ产物构建了重组克隆质粒ｐＧＥＭ／ＵＮＧ,ＤＮＡ序列分析结果确证其中含有完整的ＵＮＧ基因。利用该重组质粒,进一步构建了重组表面质粒ｐＢＶ／ＵＮＧ。     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre.将位于质粒pTIABn中的雄性不育基因表达盒(含TA 29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp 2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn.PCR方法从溶原菌BM 25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35 S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre.     

Bt工程菌高性能载体研究进展

近30年来,以苏云金杆菌为基础利用ICPs基因构建性能优良的重组菌株和生产遗传重组杀虫剂成为生物农药公司的主要目标。生物工程杀虫剂相继商品化,用于防治重要经济作物的害虫。为了增强工程菌的杀虫效果,研究者在构建高性能载体方面开展了大量研究并取得显著进展。文章对该领域研究进展做一简要综述。     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

枯草杆菌ylyA基因表达载体的构建及诱导表达

ylyA是枯草杆菌的一种功能未知基因,本研究旨在建立YlyA的诱导表达体系,为其结构分析和功能研究奠定基础。PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSIII中构建表达载体pNG252,测序分析无突变后用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析。实验结果表明:pNG252中ylyA插入方向正确,序列无突变;新鲜的转化子培养至OD600为0.7左右时,用0.000 5 mol.L-1IPTG,37℃诱导3 h,YlyA高效表达。因此本研究成功构建了YlyA高效可诱导表达载体并建立了YlyA蛋白的诱导表达条件,所得到的6×His-YlyA融合蛋白,纯化后可用于YlyA晶体结构分析和功能研究。     

棉纤维特异启动子E6基因表达载体的构建

以棉花cDNA为模板克隆了棉花纤维特异启动子E6,从质粒RDB1上切下植物的35S启动子,置换上棉纤维特异启动子E6.经PCR及酶切鉴定,得到了含E6基因的植物表达载体.     

核桃TT1类转录因子的筛选及干旱响应分析

TT1基因（transparent testa1）在植物逆境响应中有重要作用。核桃是重要的经济树种,其产量和质量均受环境影响。为进一步探索核桃（Juglans regia）抗逆机制,以‘香玲’核桃为试验材料,克隆获得核桃JrTT1基因,并进行基因表达和生物信息学分析,预测该基因的基本生物功能。结果表明,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因的开放阅读框（OFR）分别为1 014、1 023、1 029 bp,蛋白分子量分别为37 763.51、38 492.94、38 136.36 u,含有氨基酸数分别为337、340、342,理论等电点分别为7.88、7.19、8.89。与其他物种的同源TT1蛋白具有较近的进化关系。且其上游1 200 bp启动子中含有多种与干旱逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）发现,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因在PEG₆₀₀₀胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在叶和根中的表达趋势不同。表明JrTT1基因可以响应干旱胁迫诱导,并具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中具有一定作用。     

核桃无融合生殖研究初报

通过去雄花和雌花套袋隔离,研究了我国１１个核桃品种（系）的无融合生殖现象。结果表明,在供试的１１个核桃品种（系）中,其中有４个品种（系）具有一定的无融合生殖能力,无融合生殖品种占供试品种（系）的３６．４％。４个无融合生殖品种（系）的无融合生殖率在１．５％～１３．０％之间,并表现出不同年份上的差异。     

安康核桃优良种质资源调查研究

本文通过对安康市核桃资源进行踏查初选、复选,最终筛选出编号为YP-QT-G3、JK-GQ-1、JK-GQ-6、FQ-五-2、GX-YJZ-5、SY-8、MZ-FS-1、CG-DF-1的8株本地核桃优良单株,及三棱核桃、珍珠核桃、薄皮核桃、紫仁核桃、串核桃5种核桃变异类型,为收集利用秦巴山区核桃优质种质资源奠定了工作基础。     

陕西蓝田核桃内生真菌多样性与时空分布

为了解陕西蓝田核桃(Juglans regia L.)内生真菌生态多样性与分布特性,采用组织分离法对不同季节的核桃树的不同组织部位进行内生真菌分离,以形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定。共分离获得核桃内生真菌676株,隶属于47个属,其中交链孢霉属(Alternaria)为优势类群,占菌株总数的19.23%;茎叶核菌属(Ectostroma)和葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)相对较丰富,分别占菌株总数的8.73%和6.21%。核桃不同部位内生真菌的多样性以茎部最高,1年生茎和2年生茎分别占菌株总数的24.56%和24.41%。不同季节的核桃内生真菌中,秋季(2013年10月)的多样性最高,分布于19个属,占菌株总数的34.91%。不同组织部位的核桃内生真菌多样性因季节变化而异。     

大核桃花芽分化的观察

大核桃为雌雄异株。雌花生于当年生新梢顶端,单生或2～3朵簇生,有时更多。雌花序从雌花序轴(总花梗)原基出现至雌蕊成熟,约需8～9个月。全过程可分为4个时期:①未分化期;②花序轴原基与雌花原基形成和发育期;③苞片原基和萼片原基形成和发育期;④心皮原基形成和发育期。雄花序花芽的分化期比雌花序花芽的分化时间要长,从雄花序花芽鳞片原基形成至雄蕊小孢子母细胞的发育成熟,约需12个月。全过程可分为3个时期:①雄花序花芽鳞片原基形成期;②雄花苞片原基形成和发育期;③萼片原基和雄蕊原基形成和发育期。     

远缘和失活花粉蒙导核桃无融合生殖的研究

通过去雄和雌花套袋隔离,用油松花粉和失活核桃花粉对核桃3 个优良品种13个单株的雌花进行蒙导,结果表明:失活花粉蒙导,可明显提高核桃的无融合生殖率,油松花粉蒙导对核桃无融合生殖的影响与对照相近。     

核桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

利用1对兼并引物,从核桃(Juglans regia)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为JrPAL.GenBank登录号为AY747676.JrPAL长866bp,编码289个氨基酸.通过核苷酸和蛋白质序列多重比较,发现JrPAL与其他植物的PAL基因高度同源.JrPAL编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性住点.PAL系统进化树表明,JrPAL与乔木类植物的PAL基因聚类关系最近.克隆JrPAL,可为利用基因工程技术调控核桃黄酮化合物的代谢提供基因资源.     

罗甸小米核桃叶绿素含量测定方法研究

研究了直接浸提法与Arnon法从罗甸小米核桃叶片中提取叶绿素的效率,并比较了两种方法的优劣。结果表明：用丙酮、乙醇浸提法提取叶绿素的效率比丙酮、乙醇Arnon法高,以乙醇与丙酮体积比1∶1的混合溶液为浸提剂时,叶绿素浸提效率最高;分别在温度50℃、料液比1∶50、浸提5 h的条件下浸提效果最好;在温度为50℃、液料比为1∶40的条件下提取6.5 h,叶绿素的提取效率最高,且3个主要因素对浸提结果影响次序依次为：浸提温度〉浸提时间〉浸提料液比。     

核桃(Juglans regia L．)光合影响因子的研究

以普通核桃'清香'为试材,利用CI-301PS便携式光合作用测定仪,在田间条件下,测定了核桃净光合速率的日变化及季节变化,进行了核桃净光合速率与光合影响因子的相关性研究,为核桃栽培管理提供一定的科学依据。结果表明:核桃净光合速率日变化与叶温极显著正相关,与光合有效辐射、蒸腾速率、气孔导度显著正相关,与胞间CO_2浓度极显著负相关。核桃净光合速率季节变化与蒸腾速率呈极显著正相关,与叶绿素含量呈显著正相关,与胞间CO_2的浓度呈显著负相关。     

核(Juglans regia L.)光合影响因子的研究

以普通核桃'清香'为试材,利用CI-301PS便携式光合作用测定仪,在田间条件下,测定了核桃净光合速率的日变化及季节变化,进行了核桃净光合速率与光合影响因子的相关性研究,为核桃栽培管理提供一定的科学依据。结果表明:核桃净光合速率日变化与叶温极显著正相关,与光合有效辐射、蒸腾速率、气孔导度显著正相关,与胞间CO_2浓度极显著负相关。核桃净光合速率季节变化与蒸腾速率呈极显著正相关,与叶绿素含量呈显著正相关,与胞间CO_2的浓度呈显著负相关。