猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究

目的：初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法。方法：经胰酶－EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣的细胞成分，测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性，并在其表面种植BAECs。结果：猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除，获得完整无细胞的纤维网状支架，瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化，瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除；种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层。结论：猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长，可以用来构建组织工程瓣膜。     

骨髓间充质干细胞和猪去细胞瓣膜支架构建组织工程瓣膜

目的 探讨运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜的方法.方法 体外培养、扩增自体骨髓间充质干细胞并鉴定,接种于以曲拉通-脱氧胆酸钠、RnaseⅠ和DnaseⅠ去细胞的猪心脏瓣膜支架上,形成细胞材料复合物,体外培养7 d,将该复合物移植于裸鼠腹腔,4周后行组织学检测.结果 骨髓间充质干细胞具有与成纤维细胞相似的生物学特性,表达ASMA,Vimentin抗原,去细胞瓣膜去细胞彻底,骨髓间充质干细胞可在支架表面良好生长,形成表面光滑的细胞层,分泌细胞外基质,生长好.在裸鼠体内可继续扩增,形成多层细胞.结论 运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜可生成初级组织工程瓣膜.     

人脐静脉内皮细胞用于构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的：以人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)为种子细胞，体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)，并对其分泌纤溶物质——组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)的作用进行观察。方法：获取并扩增HUVECs，种植在猪脱细胞主动脉瓣叶上，体外静态构建TEHV。观察内皮细胞的形态学变化和生长状况。收集瓣膜培养液，采用发色底物法检测瓣膜内皮细胞分泌的t-PA和PAI-1活性。结果：以猪脱细胞主动脉瓣叶作支架，HUVECs做种子细胞，体外成功构建TEHV，种植的HUVECs在瓣膜表面长成一层连续的细胞层，生长状态良好。瓣膜表面的内皮细胞能够分泌纤溶物质t-PA和PAI-1。结论：HUVECs种植在猪脱细胞瓣膜支架上可以构建TEHV，且瓣膜内皮细胞能够分泌t-PA和PAI-1。     

向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化（MSC-ECs）作为种子细胞,去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）。方法羊骨髓穿刺液,以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞（MSCs）,在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增,鉴定;以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上,体外三维培养,构建组织工程心脏瓣膜,研究细胞功能及组织学结构。结果MSC-ECs为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列;α-SMA、Vimentin、CD-31及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性,培养上清液NO及ET-1分别为（165．6±8．9）μmol／L及（50．6±5．6）ng／L,其中NO值明显高于未诱导组（P〈0．05）,猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;诱导分化的MSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层。结论MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。     

人骨髓基质干细胞作为心血管瓣膜组织工程种子细胞的实验研究

目的探讨人骨髓基质干细胞（human bone marrow stromal cells，hMSC）作为心脏瓣膜组织工程种子细胞的可行性。方法取胸外科手术患者肋骨骨髓，Ficoll离心法获取单个核细胞，体外培养扩增，以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原。将自然分化的hMSC接种于去细胞猪心瓣膜上2周，免疫组化检测细胞分化结果；扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况；生化检测种植细胞DNA含量和细胞外基质，并和隐静脉来源成纤维细胞构建的组织工程瓣膜作对比。结果hMSC在自然条件下能够分化表现成纤维细胞特性，Vimentin和α-SMA染色阳性；电镜观察活性成肌纤维细胞在瓣膜表面生长均匀平滑；瓣膜组织DNA和胶原含量显著高于去细胞瓣组，与成纤维细胞对照组无明显差异。结论hMSC能够在自然条件下先向成纤维细胞分化，并在去细胞猪心瓣膜上增殖生长，分泌胶原，可作为心血管瓣膜组织工程的种子细胞。     

去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣实验研究

目的 观察未经戊二醛处理的去细胞猪主动脉瓣组织相容性和可降解性，并探讨基构建组织工程瓣可行性。方法 应用体外种植犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶种植于犬腹主动脉内，观察其形态学和免疫组织化学变化。结果 （1）皮下埋藏实验显示瓣叶轻度炎症反应，10wk埋茂物完全降解吸收；（2）体外细胞种植后7d，见瓣叶表面有单层种子细胞覆盖；（3）体内，即腹主动脉内移植瓣叶，支架逐渐吸收，为新生细胞综合和分泌的纤维结缔组织所取代，至10wk末瓣叶完全重塑，在新构成的瓣叶中可检测到Ⅰ，Ⅲ型胶原、弹力纤维和粘多糖，间质细胞部分呈α－平滑肌肌动蛋白阳性表达，内皮细胞覆盖于瓣叶表面，Ⅷ因子染色为阳性。结论 去细胞猪主动脉瓣体外初步构建的组织工程瓣，移植入犬腹主动脉内经10wk观察，已初步形成具有活细胞的瓣叶组织，并提示组织相容性优于人工合成材料。     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

去细胞猪主动脉瓣膜支架的生物学特性

目的探讨以Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞后的组织工程心脏瓣膜支架的生物学特性。方法经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶处理新鲜猪主动脉瓣膜,去除内皮细胞和间质细胞,常规苏木精伊红染色,电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果,并检测去细胞瓣叶的力学特性、可溶性蛋白含量、同时行兔皮下包埋实验,观察其免疫反应性。结果Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶能有效去除细胞成分,获得组织工程心脏瓣膜支架。去细胞瓣叶与新鲜瓣叶有相同的拉伸强度-拉伸率曲线。可溶性蛋白含量明显降低,去细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞处理的猪主动脉瓣膜可以做为组织工程瓣膜支架。     

环氧氯丙烷在组织工程心脏瓣膜构建中对基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶－1（matrix metalloproteinase-1 MMP-1）表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组，用加用3％环氧氯丙烷处理24小时的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞（human bone maiTow derived stroma cells BMSCs）种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve 1EHV），分别行石蜡包埋切片、HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构，并行逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定BMSCs分泌MMP-1的功能。结果BMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好，MMP-1的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架，可以抑制BMSCs的MMP-1表达。     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

直接染色法观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长

为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况，采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架，将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上，第3、7天取瓣叶行H－E直接染色，并以常规切片H－E染色和扫描电镜作为对照。结果发现，该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。提示，瓣叶H－E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况。     

环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中MMP-9表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9;MMP-9)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,用3%环氧氯丙烷处理48h的去细胞支架材料作为实验组;用0.2%戊二醛处理48h的去细胞支架材料作为对照组。将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchy-mal stem cells;hBMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valves;TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,免疫组化检测MMP-9表达的阳性率。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-9的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-9表达,对防止组织工程心脏瓣膜钙化的形成有一定作用。     

环氧氯丙烷防止去细胞生物瓣膜钙化的初步研究

目的研究环氧氯丙烷对去细胞生物瓣膜钙化的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的去细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用3%环氧氯丙烷处理24h的去细胞猪主动脉瓣膜支架作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞（hBMSCs）种植于去细胞支架上,分别行Western blot及原位杂交方法测定人骨髓基质干细胞分泌基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）的功能。结果人骨髓基质干细胞在实验组去细胞瓣膜表面生长良好,MMP-2,9的表达比对照组降低,有统计学意义（P〈0.05）。结论环氧氯丙烷处理的去细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制人骨髓基质干细胞的MMP-2,9的表达,对防止去细胞猪主动脉瓣膜支架钙化的形成有一定作用。     

牛心包组织工程心脏瓣膜支架脱细胞的研究

目的研究去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,去除新鲜牛心包组织细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料。方法分别采用去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,处理新鲜牛心包组织,光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异。结果3种方法均能完全去除细胞,与去污剂-酶消化法比较,其他2种方法对基质的破坏明显。结论去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且具有良好的保护基质能力。