基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法

目的 引入一种设计简易、特异性强、退火温度范围宽的双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）设计,建立基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌16S 23SrRNA基因为靶基因,设计一对DPO引物,经过PCR反应体系优化,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法.测定了检测灵敏度,以常规PCR方法作为参照,分析DP＆PCR方法的特异性及退火温度.结果 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法的灵敏度为1.43×102 CFU/mL;与常规PCR方法相比,DP＆PCR方法在49～69℃退火温度范围内均能保持高效率扩增;特异性强,所测试17种病原菌中,仅小肠结肠炎耶尔森氏菌为阳性结果,且无非特异性扩增.结论 DPO-PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度进行优化,特异性强,为致病微生物的快速准确检测提供了新方法.     

疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立

目的 建立疟疾消除后高效的蚊媒监测多重PCR方法。方法 设计疟原虫属、人血、中华按蚊和蚊通用4对特异性引物,与通用引物（5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′）连接后,形成4对嵌合特异性引物。常规PCR确定各引物对的最佳退火温度和引物工作浓度,多重PCR优化4对引物混合后的最佳反应条件,引入模拟风险感染阳性蚊虫样品,建立敏感的多重PCR反应体系。检测4种疟疾（间日疟、卵形疟、恶性疟、三日疟）患者全血样品的原虫密度梯度稀释样品的各基因扩增情况,评估检测灵敏度。用溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、日本血吸虫尾蚴、卫氏并殖吸虫、蛔虫、牛带绦虫、猪带绦虫等11种其他寄生虫虫体DNA或感染样品评价该方法的检测特异性。用畜圈周围采集的野生中华按蚊样品,评价所建PCR方法的应用效果。结果优化后的多重PCR反应体系各组分含量（体积比）为：DNA模板10%、引物Mix10%、三蒸水30%, Taq酶预混液50%。引物Mix中,蚊通用、按蚊、人血和疟原虫引物的用量配比为1∶1.75∶3∶5。反应体系的最佳循环条件为：95℃5 min; 94℃...     

狂犬病病毒核酸RT-LAMP检测方法的建立

目的建立RT-LAMP方法,实现对狂犬病病毒核酸的快速、灵敏、简便的检测。方法针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因（N基因）和大转录酶蛋白基因（L基因）中的高度保守区段分别设计了一套引物,建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录-环介导恒温扩增（RT-LAMP）方法。样品提取总RNA后,加入BstDNA聚合酶、各种反应成分,于63℃恒温水浴箱中放置60min,80℃5min终止反应,加入荧光染料SYBR GREEN I,根据颜色变化肉眼判定结果。结果两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测,均有良好的特异性,灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。结论该方法简单、快速,不需电泳,利用染色剂肉眼判定结果,不需要大型仪器,能在70min内完成对狂犬病病毒RNA的检测,适用于可疑动物的快速检测,尤其适合基层使用。     

尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用

目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法。方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测。结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100%。特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL。100份临床样品检测结果全部为阴性。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒 N基因的巢式RT-PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域。     

食品中单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的利用荧光定量PCR技术,建立食品中单核细胞增生李斯特菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以单核细胞增生李斯特菌的-hlyA基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以单核细胞增生李斯特菌菌株,提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和退火温度,以单核细胞增生李斯特菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8μmol/L,0.6μmol/L,退火温度为60℃时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除单核细胞增生李斯特菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限19cfu/ml。稳定性分析表明同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5%。检测样品结果显示Real-timePCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

均匀设计法在实时定量PCR检测条件优化中的应用研究

目的探索均匀设计在优化实时定量PCR检测条件中的应用,确立心钠素基因实时定量的最佳条件。方法以乳鼠心肌细胞cDNA为模板,退火温度和引物浓度为影响因素,应用均匀设计法探索影响心钠素基因实时荧光定量PCR的扩增条件;量化不同实验条件下的扩增效果,在最优的扩增条件下建立ANP基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计法的试验设计,用8个试验点,完成了对温度和引物浓度2因素8水平的实验条件优化,建立了ANP基因实时定量PCR检测的最佳组合,为退火温度59.2℃、引物终浓度200μM。结论均匀设计是一种简便易行、快速经济的实时定量PCR检测条件的优化方法。     

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23SrRNA基因部分序列设计1套（共4条）能够识别6个区域的特异性引物；优化扩增条件；评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法，成功地建立了环媒恒温基因扩增（LAMP）检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。     

应用实时高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体北大核心CSCD

目的 应用实时高分辨率熔解曲线PCR技术建立特异性强、灵敏度高和稳定性好快速检测巴尔通体物种方法。方法 查找巴尔通体属特有基因ssrA特异引物进行常规PCR扩增,随后将扩增产物连接到pEASY？-T5Zero克隆载体上制备标准品。优化扩增反应的退火温度和引物浓度,评估实时高分辨率熔解曲线方法的特异性、敏感性及重复性,并与常规PCR进行比较。结果 优化的退火温度为60℃,引物浓度均为300nmol/L。特异性实验结果显示只有巴尔通体物种扩增出荧光信号,且相对应的熔解温度值为81.05℃±0.31,阴性对照菌株均未见荧光信号和熔解曲线;敏感性实验结果显示在20μL的反应体系中,实时高分辨率熔解曲线方法检测汉赛巴尔通体物种最低检出限为3.82×101个拷贝,比常规PCR敏感性提高了100倍,此外也显示出良好的线性关系和扩增效率,相关系数R2分别为0.999,E值分别为98.4%。重复性实验结果显示组内和组间的变异系数值为0.30%~0.62%和0.29%~0.36%,在允许范围内。结论 建立的实时高分辨率熔解曲线PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速地检测鉴定巴尔通体物种,为巴尔通体所引起的猫抓病、战壕热、心内膜炎、杆菌性血管瘤和卡瑞恩病等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

基于PCR的金葡菌准确检测方法的建立及应用

目的建立基于PCR的金葡菌准确检测方法。方法选择nuc基因的一段保守序列并设计引物。采用PCR扩增技术对117株金葡菌的nuc保守区域进行扩增,然后采用焦磷酸测序对PCR产物进行特异性检测。同时采用传统细菌分离培养法和PCR扩增nuc基因法对16份生鸡肉样品进行金葡菌检测。结果建立的检测方法可准确鉴定117株金葡菌,准确率100%。在16份生鸡肉样品检测中,PCR法检出6份金葡菌阳性样品,阳性率为37.5%;传统细菌分离培养法检出5份阳性样品,阳性率为31.3%。结论建立的基于PCR的检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可适用于金葡菌的准确检测。     

ACT1-qPCR定量分析弓形虫内参引物的筛选与鉴定

目的运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(q PCR)分析的内参引物。方法体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA。合成弓形虫MIC6基因(Toxo DB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照。依照Toxo DB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(Toxo DB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp。以弓形虫RH DNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度。运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫q PCR定量分析的内参引物。结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA MIC6基因时均出现一条长度约为1 050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用。优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或q PCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度。以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致。此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现。结论引物P11(5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫q PCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物。     

猪嵴病毒 SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKV）株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测PKV 3D蛋白在6.42×102 ~ 6.42×108拷贝/反应范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为（84.94±0.24）℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%~1.14%,组间变异系数0.63%~1.79%,重复性好。本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染程度和靶器官提供新的检测方法。     

胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用

目的 建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法。方法 以胎儿弯曲菌表面蛋白基因sapB2为靶基因,应用软件设计特异性引物,通过反应条件的优化,引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测,建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法并应用于临床样品检测。结果 该研究建立的PCR方法能特异性扩增胎儿弯曲菌sapB2(789 bp)基因片段,空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌以及其他17株参考菌如大肠杆菌、沙门菌等均未扩增出条带;胎儿弯曲菌纯培养物最低可检出0.23 pg/μL的DNA,模拟感染样品污水和奶牛粪便样品中胎儿弯曲菌的最低检出量分别为0.9 CFU/mL和20 CFU/g;临床样品检测中,400份奶牛肛门擦拭样品和125份产妇阴道擦拭样品的PCR检测结果均为胎儿弯曲菌阴性,与传统的平板分离方法同步检测结果一致。结论 所建立的胎儿弯曲菌PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点,为胎儿弯曲菌的快速检测提供了技术支持,对识别该菌株的暴发流行,相关疾病的诊断和控制具有重要意义。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测HPV16及HPV58方法的建立北大核心CSCD

目的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种快速、可视化的HPV16、HPV58检测方法。方法运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16E6基因及HPV58L1基因保守区域设计引物及探针。采用生物素标记LF,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,LFD进行目视检测,建立HPV16和HPV58的LAMP-LFD检测方法,并对其特异性、灵敏度及临床实用性进行验证。将临床样品使用该方法的检测结果与实时LAMP扩增及qPCR结果相比较,计算符合率。结果优化的LAMP最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50min。LFD检测仅需5min,故完成检测耗时仅55min;建立的LAMP-LFD方法能特异性检出HPV16、HPV58,其他5种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μl,50份临床样品检测结果与实时LAMP和qPCR检测的符合率达100%。结论建立的HPV16、HPV58LAMP-LFD检测体系快速、简便,可视化。该方法对设备的要求低,仅需恒温孵育器即可完成,结果易观察,适用于现场HPV检测,以及经济落后和资源匮乏地区的HPV筛查。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测HPV16及HPV58方法的建立

目的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种快速、可视化的HPV16、HPV58检测方法。方法运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16E6基因及HPV58L1基因保守区域设计引物及探针。采用生物素标记LF,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,LFD进行目视检测,建立HPV16和HPV58的LAMP-LFD检测方法,并对其特异性、灵敏度及临床实用性进行验证。将临床样品使用该方法的检测结果与实时LAMP扩增及qPCR结果相比较,计算符合率。结果优化的LAMP最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50min。LFD检测仅需5min,故完成检测耗时仅55min;建立的LAMP-LFD方法能特异性检出HPV16、HPV58,其他5种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μl,50份临床样品检测结果与实时LAMP和qPCR检测的符合率达100%。结论建立的HPV16、HPV58LAMP-LFD检测体系快速、简便,可视化。该方法对设备的要求低,仅需恒温孵育器即可完成,结果易观察,适用于现场HPV检测,以及经济落后和资源匮乏地区的HPV筛查。     

牛隐孢子虫多重PCR方法的建立及应用

摘要：目的 为寻求一种牛源隐孢子虫的快速检测手段。方法 根据牛隐孢子虫COWP基因和ITS-1基因,设计合成两对特异性引物,用以特异性扩增牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫,扩增长度分别为1033bp和263bp。通过反应条件的优化,特异性试验及扩增片段的序列测定的验证,建立多重PCR方法。结果 应用该方法对采集自广西不同地区的1613份牛粪样进行牛隐孢子虫检测,安氏隐孢子虫阳性粪样为189份,微小隐孢子虫阳性粪样1份,与常规隐孢子虫分离鉴定结果一致。结论 表明该方法可用于隐孢子虫的流行病学调查及临床诊断。     

应用实时高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体

目的应用实时高分辨率熔解曲线PCR技术建立特异性强、灵敏度高和稳定性好快速检测巴尔通体物种方法。方法查找巴尔通体属特有基因ssrA特异引物进行常规PCR扩增,随后将扩增产物连接到pEASY^􀆿-T5 Zero克隆载体上制备标准品。优化扩增反应的退火温度和引物浓度,评估实时高分辨率熔解曲线方法的特异性、敏感性及重复性,并与常规PCR进行比较。结果优化的退火温度为60 ℃,引物浓度均为300 nmol/L。特异性实验结果显示只有巴尔通体物种扩增出荧光信号,且相对应的熔解温度值为81.05 ℃±0.31,阴性对照菌株均未见荧光信号和熔解曲线;敏感性实验结果显示在20 μL的反应体系中,实时高分辨率熔解曲线方法检测汉赛巴尔通体物种最低检出限为3.82×10¹个拷贝,比常规PCR敏感性提高了100倍,此外也显示出良好的线性关系和扩增效率,相关系数R²分别为0.999,E值分别为98.4%。重复性实验结果显示组内和组间的变异系数值为0.30%~0.62%和0.29%~0.36%,在允许范围内。结论建立的实时高分辨率熔解曲线PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速地检测鉴定巴尔通体物种,为巴尔通体所引起的猫抓病、战壕热、心内膜炎、杆菌性血管瘤和卡瑞恩病等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

空肠弯曲杆菌LAMP检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种灵敏的环介导等温扩增方法（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）用于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的快速检测。方法：根据已公布的空肠弯曲杆菌旋转酶基因（gyrA）设计引物,建立并优化LAMP反应体系,对检测方法的特异性和灵敏度进行验证,并运用该方法对我国不同地方鸡种空肠弯曲杆菌的携带率进行调查。结果 该方法能扩增出典型的梯形条带,且扩增产物的酶切鉴定结果与理论值相符;对单增李斯特菌等8株实验菌株进行检测,仅空肠弯曲杆菌的LAMP结果为阳性;该方法检测空肠弯曲杆菌纯培养物的灵敏度为20cfu／mL,高于常规PCR检测方法10倍;不同地方鸡种空肠弯曲杆菌携带率介于6%～90%之间,差异显著。结论 本试验建立的空肠弯曲杆菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高,有望在临床样品检测中发挥作用。     

PCR法检测16S rRNA基因在败血症诊断中的价值

目的评价外周血细菌16S rRNA基因检测诊断败血症的敏感性及特异性。方法利用通用引物对6种常见细菌16S rRNA基因进行扩增，通过阳性菌株及阴性对照检测引物的特异性；观察不同退火温度及不同细菌浓度下PCR检测效果；检测败血症患者及正常人血液标本中的16S rRNA基因表达，并与血培养结果进行比较，评价其诊断意义。结果6种阳性菌株均出现特异阳性条带，阴性质控未出现阳性条带；不同退火温度对PCR结果无明显影响，以55、58℃最佳；PCR方法的最低细菌检测浓度为1．5×10^3cfu／ml；观察组血培养阳性率为38．3％（23／60），血液16S rRNA基因阳性表达率为86．6％（52／60），P〈0．01。结论PCR法检测16S rRNA基因用于败血症诊断特异性及敏感性强，但应注意规范操作、避免污染。     

一种侧流试纸结合FAM重组酶聚合酶扩增(RPA)诊断布鲁氏菌感染的方法

目的 为了更加方便布鲁氏菌病(布病)检测,增加布病检测方法的多样性。方法 根据布鲁氏菌特异基因的保守序列,设计引物与探针,利用Twist Amp^○Rnfo试剂盒提供的聚合酶扩增体系对布鲁氏菌基因组进行快速等温扩增,扩增产物用PCRD试剂盒侧流试纸进行检测,进而判断结果。其实验过程为确定最佳反应条件,检测特异性和敏感性,并与QPCR同时检测样品,比较符合率。结果 38 ℃反应10 min为最佳条件,特异性结果良好,敏感性能达到10^-5(8拷贝),与QPCR检测结果符合率高,以此建立本方法。结论 该方法具有特异性强、敏感性好、操作过程简单、检测快速等优点,增加了布病检测方法的多样性,同时为野外田间布病的检测提供了一种可能。