人骨髓间充质干细胞经富血小板血浆诱导后的增殖与成骨的分化能力

目的 通过系统评价经富血小板血浆(PRP)诱导后的人骨髓间充质干细胞(HMSC)增殖与成骨分化能力,为PHP临床骨缺损修复应用提供更为全面的依据.方法 将单纯血清培养(FCS)与PRP诱导后的HMSC分为FCS组、PRP组(PRP诱导后的HMSC),MTT法检测细胞增殖活性;将MSC分为PRP组、FCS组、地塞米松组(PRP诱导后的HMSC加DEX组),通过ALP染色、钙盐沉积染色、RT-PCR法检测ALP、OC、Coll-Ⅰ、ON、Cbfal、TGF-β1 mRNA表达来评价成骨分化能力.结果 PRP组HMSC增殖能力同FCS组相比差异无统计学意义(P＞0.05);ALP、OC、Coll-Ⅰ、ON、Cbfal mRNA表达显示PRP组与FCS组无明显差别;同FCS组相比PRP组TGF-β1 mRNA表达增高;同PRP组、FCS组相比,PRP诱导后的HMSC经DEX作用后(DEX组),ALP阳性细胞数钙盐沉积明显增多,ALP、OC mRNA表达增高.结论 PRP诱导后的HMSC能恢复到正常的增殖速率;PRP诱导后的HMSC具有与正常的HMSC相同的成骨分化能力,在体外仍可经DEX诱导向成骨细胞分化,PRP诱导后的HMSC仍能维持较强的成骨分化活性;PRP作用后的HMSC能维持较高的TGF-β1分泌.这是PRP在体内促进骨修复的可能原因之一.     

富血小板血浆通过调节细胞周期抑制蛋白p27促进大鼠脂肪干细胞成骨分化

目的 观察富血小板血浆(PRP)通过调节细胞周期蛋白p27表达,促进脂肪干细胞(ADSCs)向成骨细胞分化过程中的具体机制.方法 酶消化法获得大鼠ADSCs,观察PRP对大鼠ADSCs向成骨细胞分化的影响.流式细胞仪检测PRP作用与ADSCs对细胞周期和细胞周期蛋白表达的影响,Western blot法检测细胞周期蛋白表达的变化.结果 PRP干预组ADSCs增殖率为41.0％,空白对照组增殖率为7.4％.S期ADSCs的比例由诱导前的26.5％提高到67.9％.结论 PRP通过下调细胞周期抑制蛋白,提高ADSCs的增殖和分化率,促进ADSCs的成骨分化.     

富血小板血浆对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对体外培养的中国青山羊骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）增殖和成骨分化的影响,探讨PRP促进骨修复的细胞学机制。方法将体外培养第3代中国青山羊MSCs,分为对照组（单纯血清培养组）和PRP组（加入10%PRP复合培养）,通过相差显微镜观察细胞生长情况,于2、4、6、8d采用MTT法检测细胞增殖活性。将体外培养的第3代细胞分为对照组、地塞米松组（dexamethasone,DEX）组、PRP组,于培养第7天行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、第18天行矿化结节染色检测细胞成骨分化活性。结果相差显微镜下见PRP组细胞最先达到汇合,MTT法显示PRP组2、4、6、8d的平均吸光度（A）值分别为0.252±0.026、0.747±0.042、1.173±0.067、1.242±0.056明显高于对照组（A值分别为0.137±0.019、0.436±0.052、0.939±0.036、1.105±0.070）（P〈0.01）。与对照组比较,PRP组ALP阳性细胞数增多,矿盐沉积减少;DEX组ALP阳性细胞数减少,矿化结节形成明显增多。结论PRP能明显促进中国青山羊MSCs增殖,抑制MSCs向成骨细胞分化。     

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功能的促进作用

目的观察辛伐他汀对体外培养的人骨髓基质干细胞(humanBoneMarrowStromalcells,hMSCs)成骨分化功能的影响,探讨其刺激成骨的作用机制。方法体外培养来自于股骨颈骨折患者的骨髓基质干细胞,传代后实验组加入1×10-7molL的辛伐他汀,于不同时间点采用Westernblot检测核转录因子1(CoreBindingFactor1,Cbfa1)的表达,碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP)试剂盒检测ALP的比活性,及放射免疫法检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)含量。结果辛伐他汀作用后,实验组与对照组比较,实验组Cbfa1蛋白表达水平增高,ALP比活性增高且骨钙素含量增加。结论1×10-7molL辛伐他汀能够促进人骨髓基质细胞成骨分化,此种促进作用可能与辛伐他汀增强其分化过程中相关蛋白的表达有关。     

地塞米松调节骨髓基质细胞成脂及成骨分化的研究

目的　观察激素对骨髓基质细胞脂肪特异性基因aP2mRNA及成骨基因Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法　以地塞米松 (1× 10 -7mol/L)作为诱导剂 ,采用完整细胞斑点印迹分子杂交方法检测实验组和对照组中aP2和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果　实验组aP2mRNA含量4847.7± 40 6 .4明显高于对照组 15 7.6± 10 .8,其Ⅰ型胶原mRNA含量 44 2 .3± 5 7.8明显低于对照组 5 35 3 .6± 36 4.6。结论　地塞米松能够从基因调控水平诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化 ,减少其向成骨细胞分化 ,这可能与激素性骨坏死的发病机制有关。     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

人骨髓基质干细胞体外诱导培养的新方法研究

目的为骨组织工程的临床应用提供一种新的人骨髓基质干细胞(BMSCs)培养方法,以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入。方法采用10%富血小板血浆(PRP)替代动物血清配比高糖DMEM培养基,体外诱导培养(50μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)人BMSCs,快速扩增后,倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及细胞增殖情况。ALP染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果人BMSCs24h开始贴壁,7d左右细胞融合。诱导培养后细胞能较快地扩增;ALP染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。结论以自体PRP替代动物血清体外诱导培养人BMSCs是一种良好的培养方法,所培养的细胞数量及其生物学特性能快速达到临床应用的需求。     

复合细胞和人工骨的富血小板血浆成骨能力研究

目的探讨复合细胞和人工骨的富血小板血浆（platelet—rich plasma，PRP）促进骨缺损修复的能力。方法取新西兰大白兔骨髓，分离培养骨髓基质干细胞（marrow stromal stem cells，MSCs）；取兔全血体外诱导培养为类成骨样细胞，应用低密度两次离心法制备PRP。取48只1岁左右新西兰大白兔建立双侧桡骨1．2cm骨缺损模型，根据缺损中植入材料的不同随机分为4组，每组12只。A组：左侧PRP／Mscs／β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，pTCP），右侧MSCs／β-TCP；B组：左侧自体骨，右侧PRP／Mscs／β-TCP；C组：左侧自体骨，右侧MSCs／β-TCP；D组：左侧PRP／β-TCP，右侧β-TCP。术后2、6及12周通过大体观察、X线片、组织学及生物力学观察桡骨缺损的愈合情况。结果制备的PRP血小板浓度稳定，约为全血的5．45±0．23倍。大体标本与X线片显示2、6周时PRP／MSCs／β-TCP在缺损处桥接及新生骨外形较自体骨差，与MSCs／β-TCP无明显区别；12周，PRP／MSCs／β-TCP在缺损处桥接及新生骨外形接近于自体骨，优于MSCs／β-TCP。组织学观察，在新生骨数量及成熟度方面，术后各时间点PRP／MSCs／β-TCP明显优于MSCs／β-TCP（P〈0．05），PRP／MSCs／β-TCP与自体骨无差异（P〉0．05）；2、6周PRP／β-TCP与β-TCP无差异（P〉0．05）；12周PRP／β-TCP优于β-TCP（P〈0．05）。新生骨生物力学强度检测，6、12周PRP／MSCs／阻TCP优于MSCs／β-TCP（P〈0．05）；6周PRP／MSCs／β-TCP小于自体骨（P〈0．05），但12周与自体骨无差异（P〉0．05）；12周PRP／β-TCP与β-TCP无差异（P〉0．05）。结论PRP复合MSCs和β-TCP显示出了良好的成骨能力，PRP可通过提高MSCs和成骨细胞的增殖与分化活性，促进骨缺损的修复。     

地塞米松对人骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响的初步报告

目的探讨不同浓度的地塞米松对骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响。方法取人骨髓分离培养骨髓基质干细胞,经传代后分别置入地塞米松1×10-8mol/L(A组)、1×10-7mol/L(B组),应用Rt-PCR技术分别扩增成脂基因mPNA(PPARγmRNA)、成骨基因mRNA(Osteocalcin mRNA)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像扫描系统做半定量分析,以PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA与β-actin的吸光度比值表示上述产物mRNA的相对含量。结果对A组和B组通过凝胶成像扫描系统作PCR产物半定量分析,显示B组细胞中的Osteocalcin mRNA表达降低,而A组细胞中的表达增加。而且B组中的PPARγmRNA表达升高,A组降低。两者之间的差异均有统计学意义。结论地塞米松可以从分子水平调控骨髓基质干细胞的的分化。地塞米松浓度为1×10-7mol/L时,诱导骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,同时减少、抑制其向成骨细胞分化,这可能是激素骨坏死发生的机制之一。诱导体外培养的骨髓基质干细胞分化为成骨细胞,地塞米松浓度为1×10-8mol/L是比较适宜的。     

富血小板血浆复合骨髓基质细胞修复兔颅骨缺损的实验研究

目的 研究利用富血小板血浆(PRP)复合骨髓基质细胞(BMSCs)修复兔颅骨缺损,评价其作为骨组织工程支架的可行性.方法 经穿刺抽吸兔骨髓,培养BMSCs,离心制备PRP.利用10只新西兰大白兔制作直径5mm、每只兔4个全层颅骨缺损.收集原代培养的BMSCs接种于PRP或全血中.用小牛凝血酶激活接种后的复合物及PRP,而后分别植入颅骨缺损区,余下的骨缺损区作为空白对照.术后8周检查缺损区骨修复并利用X线分析成骨情况.结果 在PRP/BMSCs材料植入8周后,缺损区有大量的新骨生成,而以PRP 修复的缺损区有较少的新骨形成.与此相反,在空白对照组及blood/BMSCs植入的缺损区未见新骨形成.结论 PRP/BMSCs复合物可成功修复兔颅骨缺损,表明PRP 能够作为骨组织工程的支架.     

地塞米松对骨髓间充质细胞增殖及成骨、成脂分化的效应

目的 探讨不同浓度地塞米松(dexamethasone,DEX)作用不同时间对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及成骨、成脂分化的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将状态良好的第三代细胞接种于96孔板中,随机分组为对照组(不加入DEX)及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养1、3、5、7、9 d后,分别用细胞增殖检测(CCK-8)法检测细胞增殖状况.将BMSCs接种于6孔板中,随机分为对照组及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养7、14 d后分别用荧光定量PCR方法检测成骨、成脂相关基因的表达,培养14 d后用Western blot检测成骨、成脂相关蛋白的表达.培养5 d后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,培养14 d后进行油红"O"染色、茜素红染色.结果 较低浓度的DEX促进BMSCs增殖,而较高浓度DEX抑制BMSCs增殖.干预早期,较低浓度的DEX促进BMSCs成骨分化而高浓度DEX抑制其成骨分化;干预晚期,各浓度DEX均促进BMSCs成骨指标的表达,但是不能诱导BMSCs钙质沉积.DEX浓度依赖性地促进BMSCs成脂相关指标基因和蛋白的表达,并诱导BMSCs细胞内脂质沉积.结论 DEX可直接影响BMSCs增殖及向成骨、成脂方向分化,这种效应存在浓度和干预时间依赖性.     

仿生电刺激在体外促进人骨髓间充质干细胞株向肝细胞分化的研究

目的 探讨仿生电刺激体外诱导人骨髓间充质干细胞株(UE7T-13)向肝细胞分化的作用.方法 采用静电纺丝及氧化聚合法制备聚吡咯/PLGA导电膜,并在其表面培养UE7T-13细胞株.实验按是否给予诱导因子及施加电刺激分为四组:电刺激+诱导因子组、电刺激组、诱导因子组以及空白对照组.诱导因子包括HGF、EGF、FGF及OSM等.电刺激为每日给予频率5Hz、脉宽5 ms、电压100 mV(电流强度100 μA)的仿生电刺激2h.每天常规收集培养液,检测其中白蛋白分泌、尿素合成、细胞色素P450活性.MTT法检测细胞增殖能力,细胞免疫荧光方法检测各组干细胞中白蛋白和甲胎蛋白的表达.结果 电刺激+诱导因子组及诱导因子组UE7T-13细胞均成功诱导出类肝样细胞.与单纯诱导因子组比较,电刺激+诱导因子组UE7T-13更早向肝细胞转化,其肝细胞特异功能表达及表面特异蛋白分子表达更强.UE7T-13细胞在有电刺激存在时增殖能力明显提高.结论 仿生电刺激可促进体外UE7T-13细胞增殖及其肝向分化,使其更早出现肝细胞特异性分子表达,并提高分化效率.     

低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及相关基因表达的影响

目的 观察低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的影响。方法 取3周龄C57BL/6小鼠,分离及培养其BMSCs。将细胞分为两组,对照组及低频振动组,两组均诱导BMSCs进行成骨分化,低频振动组在诱导过程中实施低频振动干预（15 Hz,垂直加速度0.3 g）,对照组不进行干预,分别于第7天、第14天收获细胞,将第7天的细胞进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色,将第14天的细胞进行茜素红染色;并利用Real-time PCR检测相关基因表达。结果 低频振动组细胞第7天的ALP活性明显高于对照组,且在14 d形成的钙结节多于对照组;所检测基因中,低频振动组细胞Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、骨保护素基因的表达均高于对照组,而破骨细胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）较对照组低。结论 低频振动可以促进BMSCs的成骨分化,并调节成骨细胞分泌的细胞因子,影响破骨细胞的生成。     

BMSCs在糖尿病胰腺微环境下分化的可行性研究

目的 BMSCs在体外分化为胰岛素分泌细胞存在分化效率低、成熟度差的问题。研究BMSCs在糖尿病猪胰腺微环境下分化为胰岛素分泌细胞的可行性。方法取1只4周龄雄性贵州小香猪骨髓,采用贴壁法制备BMSCs。15只8～10周龄雌性贵州小香猪,体重8～10 kg,随机分为正常组(A组)、糖尿病组(B组)和BMSCs移植组(C组),每组5只。B、C组连续3 d从耳缘静脉推注链脲菌素加四氧嘧啶溶液,连续2 d血糖>17 mmol/L提示糖尿病造模成功。C组将标记增强型绿色荧光蛋白(enhanced green?uorescent portein,EGFP)的第3代BMSCs(细胞密度为5×107个/mL)1.1 mL多点注射移植至胰腺包膜下,A、B组注射等量生理盐水。监测血糖至30 d后,取胰腺组织行HE染色观察并检测胰岛数目及直径;免疫荧光组织化学染色检测新生胰岛的胰岛素表达;激光捕获显微切割技术获得EGFP+细胞,提取总RNA,采用RT-PCR检测胰岛素mRNA和胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor 1,PDX1)mRNA的表达;荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测胰岛素基因和SRY(sexdetermining region ofthe Y chromosome)基因的共表达。结果移植18 d后C组血糖开始较B组明显降低,且随时间延长逐渐下降(P<0.05)。组织学观察发现BMSCs移植30 d后C组胰岛数目(10.9±2.2)个较B组(4.6±1.4)个明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),与A组(12.6±2.6)个比较差异无统计学意义(P>0.05);C组新生胰岛直径(47.2±19.6)μm,明显小于A组(119.6±27.7)μm,差异有统计学意义(P<0.05),B组未见新生胰岛。免疫荧光组织化学染色显示C组新生胰岛有胰岛素表达。RT-PCR检测示C组EGFP+细胞有胰岛素mRNA和PDX1 mRNA表达。FISH检测C组细胞中有SRY基因和胰岛素基因共表达。结论 BMSCs在糖尿病猪胰腺微环境条件下可分化为胰岛素分泌细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨分化的研究与进展

超临界大面积或大段骨缺损仍是临床面临的难题,研究者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们越来越关注骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用。本综述以骨髓间充质干细胞、成骨分化、成骨细胞、临床应用"Bone marrow mesenchymal stem cells,osteogenesis differentiation,osteoblasts cell,clinical application"为检索词,应用计算机搜索CNKI数据库、万方数据库、维普数据库、PUBMED数据库,全面归纳总结骨髓间充质干细胞的分离培养、骨髓间充质干细胞鉴定方法、成骨诱导方法、成骨分化鉴定及其在临床中的应用,为证实其作为种子细胞治疗骨组织疾病提供理论依据。学者们初步研究了骨髓间充质干细胞结合移植、组织工程等技术来治疗骨和软骨缺损、骨关节炎、股骨头坏死等疾病,均取得了较好的临床疗效。但是骨髓间充质干细胞会有一定的优缺点,其临床试验及远期疗效的验证还需进一步深入研究。     

WNT2B对人骨髓间充质干细胞成脂肪细胞分化的影响

目的观察WNT2B对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向脂肪细胞分化的影响。方法采用慢病毒载体在hMSCs中过表达WNT2B基因(实验组),以空慢病毒载体作为对照(对照组),并将hMSCs进行脂肪细胞诱导分化7 d,以实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测脂肪细胞标志基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、脂蛋白脂酶(LPL)和降脂素(Adipsin)的表达,在光镜下计数油红O染色阳性细胞的数目,并对油红O染色强度进行定量检测。计量数据组间比较采用t检验或者Mann-Whitney检验。结果在hMSCs成脂肪细胞诱导分化过程中,WNT2B的蛋白表达水平在分化早期即发生改变,实验组hMSCs的PPARγ2(3.85±0.01比0.70±0.10,t=54.289,P<0.01)、LPL(17.78±1.78比1.29±1.30,t=12.958,P<0.01)、Adipsin基因表达强度(0.88±0.11比0.38±0.05,t=7.167,P<0.01)显著低于对照组,实验组hMSCs单位面积形成脂肪细胞的数量显著低于对照组[(30.50±2.07)个比(10.33±1.63)个,t=50.230,P<0.01],油红染色定量分析显示实验组吸光度值显著低于对照组(0.77±0.02比0.49±0.02,t=10.397,P<0.01),差异均有统计学意义。结论过表达WNT2B可以抑制体外hMSCs向脂肪细胞的分化。     

羟基红花黄色素A对激素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：观察羟基红花黄色素A（HSYA）对激素诱导兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）内成骨标志物碱性磷酸酶、Cbfαl及Ⅰ型胶原表达的影响,探讨其防治激素性股骨头缺血性坏死的作用机制。方法：健康成年新西兰大白兔15只,体重0.9～1.3 kg,腹腔注射麻醉后,无菌条件下作胫骨和髂前上棘骨髓腔穿刺抽取骨髓血,分离出BMSCs,体外培养并传代,取第3代生长状态良好的BMSCs随机分为空白组,模型组及羟基红花黄色素A低、中、高剂量组。模型组用大剂量地塞米松诱导BMSCs成脂分化,抑制其成骨分化;羟基红花黄色素A低、中、高剂量组加入地塞米松作用的同时给予羟基红花黄色素A干预;空白组无特殊处理。1周后检测各组细胞内成骨标志物碱性磷酸酶活性、Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达。结果：模型组兔BMSCs内碱性磷酸酶活性较空白组明显下降（P<0.01）,Cbfαl及Ⅰ型胶原 mRNA的表达也明显降低（P<0.01）,而HSYA各组较模型组均有明显升高（P<0.05或P<0.01）.结论：羟基红花黄色素A治疗激素性股骨头缺血坏死的机制可能与对抗激素诱导下的BMSCs成骨分化减少有关。