人牙周膜成纤维细胞的体外培养

目的：建立人牙周膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：采用组织块贴附法原代培养人牙周膜成纤维细胞并传代。结果：牙周膜成纤维细胞体外培养成功率为20％。5代后细胞生长旺盛。经免疫组织化学SABC法证实为来源于中胚层的成纤维细胞。结论：采用组织块贴附法培养原代人牙周膜成纤维细胞。胰酶消化传代后，生长状况良好，可作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良

目的：改良人皮肤成纤维细胞培养方法。方法：采用培齐后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞，以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照。结果：改良法成功率为100％，43d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代；贴瓶法成功率为66．7％，47d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代结论：改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

不同年龄供体人牙周膜细胞原代培养成功率的比较

目的：通过研究供体年龄对组织块法原代培养人牙周膜细胞的影响,寻找人牙周膜细胞原代培养的最佳供体年龄,为便捷、快速地获得大量人牙周膜细胞提供理论依据。方法：将在口腔外科门诊收集正畸拔除的12～28岁青少年健康前磨牙68颗,按供体年龄分为3组：12～14岁组、15～18岁组和19～28岁组,采用组织块法原代培养人牙周膜细胞并传代,通过形态学和免疫化学染色方法对其进行鉴定。结果：不同年龄组牙周膜经组织块法原代培养获得的人牙周膜细胞的成功率不同,12～14岁组最高,成功率为66.67%;15～18岁组次之,成功率为8.57%;19～28岁组最低,成功率为0。12～14岁和15～18岁组传至第3代细胞免疫组织化学检测显示细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,表明为中胚层组织来源。结论：供体年龄对体外原代培养人牙周膜细胞成功率有很大影响,12～14岁为最佳供体年龄。     

玻片覆盖组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞及其生物活性的观察

目的 采用玻片覆盖组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞,以用于实验观察中药单体对培养人牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响,进而探讨中医药治疗牙周病的有效性及其作用机制.方法 用玻片覆盖组织块方法进行人牙周膜成纤维细胞原代培养,利用形态学、免疫组化方法鉴定其来源,通过生长曲线及贴壁率的测定来研究其生物学特性.结果 原代培养成功率为85%,细胞形态呈长梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,细胞倍增时间为54 h,细胞12 h贴壁率为96%,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好.结论 采用玻片覆盖组织块法可提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率,且简单易行,可满足中医药治疗牙周病的有效性及其作用机制的实验研究需求.     

全牙酶消化法原代培养人牙周膜成纤维细胞及鉴定

目的 探讨一种快速简便、原代培养成功率高、可重复性高的人牙周膜成纤维细胞培养方法。方法将处理后的牙齿整个用酶进行消化,原代培养人牙周膜成纤维细胞,对培养出的细胞进行形态学观察,免疫组化方法鉴定其来源,通过生长曲线研究其生物学特性。结果 8~14 d内可获得实验用成纤维细胞,原代培养成功率为90%,细胞形态呈长梭形。波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。结论采用全牙酶消化法可以快速、成功地培养出人牙周膜成纤维细胞,且简单易行,可重复性高。     

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的 比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法 刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果 组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27％,联合培养法成功率为70％.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论 联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

Effects of Shuanghuangbu on the total protein content and ultrastructure in cultured human periodontal ligament cells

Background Successful periodontal regeneration depends on the migration, proliferation and differentiation of periodontal ligament cells in periodontal defects. The total protein content and the ultrastructure demonstrate the metabolizability and activity of periodontal ligament cells. This study wasconducted to observe the effects of Shuanghuangbu, a mixture of medicinal herbs, on the total protein content and the ultrastructure of human periodontal ligament cells.Methods Periodontal ligament cells were grown to confluence and then cultured in Dulbecco‘ s modified eagle medium (DMEM) supplemented with Shuanghuangbu over the concentration range of 0 to 1000 μg/ml. The total protein content in cultured cells was determined by using Coommasie brilliant blue technique. Periodontal ligament cells were incubated in 0 and 100 μg/ml Shuanghuangbu decoction for 5 days, then observed through transmission electron microscope.Results The total protein content of human periodontal ligament cells increased in each experiment group added 10 -1000 μg/ml Shuanghuangbu respectively, and the effect of 100 μg/ml was excellent. Under the transmission electron microscope, there were more rough endoplasmic reticulumsand mitochodrias in the experiment group than those in the control group.Conclusion Shuanghuangbu stimulates the protein synthesis of human periodontal ligament cells and improves human periodontal ligament cells‘ metabolizability and activity.     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

牙周病患牙根面的不同处理对牙周膜成纤维细胞生长的影响

目的:研究牙周病患牙累及的牙根面经EDTA脱矿和富血小板血浆(PRP)单独及联合处理后对人牙周膜成纤维细胞附着、增殖的影响。方法:以因牙周病不能保留而拔除的患牙制备的牙根片为对照组,PRP和EDTA脱矿单独及联合处理患牙根片为实验组,用细胞计数法及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验分析人牙周膜成纤维细胞在病变根面上的附着和增殖。结果:未处理组的根片上有少量的细胞附着;根片经PRP或EDTA脱矿单独处理能明显增加细胞的附着(P<0.05);二者联合处理促附着效果明显增强(P<0.01)。未处理组根片上生长的细胞随时间延长数量反而下降;经PRP或EDTA单独处理的根片上的细胞有少量的增殖(P>0.05);二者联合处理细胞增殖明显(P<0.05)。结论:EDTA根面脱矿和PRP能有效促进人牙周膜成纤维细胞在牙周病患牙根面上的附着和增殖。     

人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的初步研究

目的:初步探索和建立人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的方法,为盆腔器官脱垂的基础研究提供成熟的体外人盆底成纤维细胞系。方法:临床搜集因盆腔器官脱垂(POP)或非POP的良性妇科疾病而行子宫切除患者的子宫旁韧带(包括主韧带和骶韧带),组织剪碎后采用改良的Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法进行原代培养,待细胞长至贴满培养瓶底面80%以上时,消化传代,对所培养的成纤维细胞进行形态学观察及免疫荧光鉴定其来源。结果:原代培养第3-4天开始,可见有单个成纤维细胞迁出、生长,7-10d时可见少部分细胞逐渐贴壁形成较小的成纤维细胞团,第25天左右多个细胞团生长中心爬出的成纤维细胞互相连接聚集成片,铺满培养瓶底;采用免疫组化染色进行细胞鉴定,细胞波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,证实其为成纤维细胞。结论:本研究确立了体外人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养,为后续研究POP发病机制提供成熟的体外宫旁韧带成纤维细胞。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养人牙周膜细胞骨钙素分泌的影响

目的：观察胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）对体外培养的人牙周膜细胞骨钙素分泌的影响,以探讨IGF－Ⅰ在人牙周膜细胞向成骨样细胞分化中的作用。方法：体外培养牙周膜细胞,放免法测定人牙周膜细胞骨钙素分泌量。实验分为空白对照组、IGF－Ⅰ3．125ng/ml组、IGF－Ⅰ6．250ng/ml组,IGF－Ⅰ2．500ng/ml组、IGF－Ⅰ25．000ng/ml组。结果：在含β－甘油磷酸钠和L－抗坏血酸的的下,人牙周膜细胞体外培养可产生并分泌骨钙素;随着培养时间的延长,骨钙素分泌增加,在第3周时分泌量达最大。加入生长因子IGF－Ⅰ,骨钙素分泌量呈剂量依赖性增加,结论：IGF－Ⅰ可增加人牙周膜细胞骨钙素的分泌。