PIAS1基因沉默对胰腺腺泡细胞炎症反应的影响

目的 观察活化信号转导和转录激活因子的蛋白抑制因子-1(PIAS1)基因特异性siRNA干扰大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J后对雨蛙素诱导炎症反应的影响,探讨其在胰腺炎发病中的作用.方法 采用脂质体法将靶向PIAS1的siRNA和阴性siRNA转染AR42J细胞,24 h后分别加入雨蛙素继续培养24 h.同时设脂质体+雨蛙素组、雨蛙素组及仅加PBS的对照组.Western blotting检测p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)及磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)表达;RT-PCR及Western blotting检测各组细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-6、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的mRNA和蛋白表达.结果 siRNA+雨蛙素组、阴性siRNA+雨蛙素组、脂质体+雨蛙素组、雨蛙素组及对照组细胞p38MAPK表达量分别为1.93±0.11、1.22±0.10、1.30±0.17、1.32±0.21、0.12±0.02;P-p38MAPK表达量分别为2.10±0.25、1.36±0.20、1.26±0.15、1.23±0.25、0.58±0.48,siRNA+雨蛙素组较其余各组明显增加(P值均＜0.05).siRNA+雨蛙素组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA表达量分别为1.66±0.15、1.66±0.15、1.90±0.01、1.56±0.20;蛋白的表达量分别为2.06±0.37、2.20±0.34、1.80±0.10、1.17±0.05,均较其他雨蛙素处理组表达上调(P值均＜0.05).结论 PIAS1参与雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞p38MAPK活性与下游炎症介质的表达调控.     

基因芯片筛选ghrelin miRNA转染胰腺炎细胞模型后的差异表达基因

背景:前期研究提示ghrelin在急性胰腺炎发病过程中发挥重要作用,但其机制尚不明确。目的:应用基因芯片技术筛选出ghrelin miRNA转染胰腺炎胰腺腺泡细胞后的差异表达基因。方法:以雨蛙肽构建胰腺炎胰腺腺泡细胞模型。将AR42J细胞分为ghrelin miRNA+雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组。提取细胞RNA,合成为ds-DNA,与大鼠全基因组基因芯片杂交、扫描、分析。筛选与炎症和钙通路相关的差异表达基因,并采用RT-PCR法对其中3个基因(Bcl-2、caspase-8、caspase-12)进行验证。结果:给予AR42J细胞ghrelin miRNA+雨蛙肽干预后,共筛选出2 938个差异表达基因,其中1 435个基因表达上调,1 503个基因表达下调。与CAMP/Ca2+信号通路相关的差异表达基因有60个,与炎症通路相关的差异表达基因有199个。RT-PCR结果表明,ghrelin miRNA+雨蛙肽组Bcl-2、caspase-12表达下调,caspase-8表达上调,与基因芯片筛查结果一致。结论:基因芯片技术可筛选出ghrelin miRNA转染胰腺炎胰腺腺泡细胞过程中发挥关键作用的基因,从而为研究内源性ghrelin对胰腺炎胰腺腺泡细胞的作用机制提供依据和参考。     

miR-375调控PIAS1对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨微小RNA-375(miR-375)对急性胰腺炎(AP)腺泡细胞增殖及凋亡的影响及其对信号转导和转录激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的调控作用。方法用雨蛙素(CAE)处理胰腺腺泡细胞株(AR42J细胞)构建AP模型,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western印迹分别检测miR-375与PIAS1的表达。利用脂质体转染技术分别将anti-miR-NC、anti-miR-375、si-NC、si-PIAS1转染至AR42J细胞,同时将anti-miR-375与si-NC、si-PIAS1分别共转染至AR42J细胞后加入CAE处理细胞。噻唑蓝(MTT)实验与流式细胞仪分别检测AR42J细胞增殖及凋亡。双荧光素酶报告基因实验检测miR-375对PIAS1的靶向作用。Western印迹检测CyclinD1、P21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达。结果 CAE处理后AR42J细胞中miR-375的表达升高,而PIAS1的表达降低;双荧光素酶报告基因实验证实PIAS1是miR-375的直接靶点;转染anti-miR-375后,由CAE诱导的AR42J细胞凋亡明显受到抑制,而细胞增殖能力明显增强,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达上调,P21、Bax蛋白表达下调(均P<0.05);共转染si-PIAS1后,明显促进CAE诱导的AR42J细胞凋亡,而抑制细胞增殖,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达下调,P21、Bax蛋白表达上调(均P<0.05)。结论 miR-375在AP腺泡细胞中高表达,而PIAS1低表达,沉默miR-375可通过上调PIAS1表达而抑制腺泡细胞凋亡并促进细胞增殖进而减缓AP发展进程。     

miR-324-5p靶向调控CARD9对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的探讨微小RNA-324-5p(miR-324-5p)靶向调控胱天蛋白酶募集域蛋白(CARD)9对急性胰腺炎(AP)腺泡细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法采用雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J构建急性胰腺炎模型。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)与Western印迹技术分别检测miR-324-5p、CARD9 mRNA及蛋白表达。应用脂质体转染技术分别将miR-NC、miR-324-5p mimic、si-NC、si-CARD9转染入AP腺泡AR42J细胞,噻唑蓝(MTT)与流式细胞仪分别检测AR42J细胞增殖及凋亡。双荧光素酶报告实验验证CARD9与miR-324-5p的作用关系。Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、Bcl-2、Bax、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3蛋白表达。结果雨蛙肽素处理后AR42J细胞中miR-324-5p表达水平显著低于对照组,而CARD9 mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05);分别转染miR-324-5p mimic、si-CARD9后,由雨蛙肽素诱导的AR42J细胞凋亡明显受到抑制,而细胞增殖能力明显增强,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达上调,p21、p27、Bax、酶切caspase-3蛋白表达下调(均P<0.05);CARD9是miR-324-5p的靶基因;CARD9过表达逆转了miR-324-5p过表达对雨蛙肽诱导的胰腺炎腺泡细胞AR42J增殖和凋亡的作用。结论miR-324-5p可通过抑制CARD9表达进而促进AR42J细胞增殖,抑制细胞凋亡。     

热休克蛋白A5对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用研究

目的探讨热休克蛋白A5(HSPA5)对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用。方法分别用高浓度(1×10~(-5) mol/L)、低浓度(1×10~(-11) mol/L)的雨蛙肽建立胰腺腺泡细胞损伤模型。分别将pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1、shHSPA5和shCon以脂质体法转染胰腺腺泡AR42J细胞,用qRT-PCR法检测细胞中HSPA5 mRNA的表达,MTT法检测细胞活力,Western blot检测细胞中HSPA5的蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组相比,高浓度和低浓度的雨蛙肽均能造成胰腺腺泡细胞损伤,且HSPA5在其中高表达。敲减HSPA5可加重胰腺腺泡细胞的损伤,过表达HSPA5可减轻胰腺腺泡细胞损伤,还可以逆转雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤作用。结论 HSPA5可修复雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤,这将为胰腺炎的治疗提供新方向。     

ATF5基因siRNA对肺癌细胞凋亡及化疗增敏的机制

目的探讨转录激活因子(ATF5)基因siRNA对肺癌细胞活力、凋亡及化疗敏感性的影响。方法将ATF5的特异性siRNA(ATF5-siRNA组)转染人肺癌A549细胞,同时转染阴性对照siRNA(阴性组),并设置空白组。采用Western印迹检测ATF5表达沉默效果。噻唑蓝(MTT)、流式细胞术、Western印迹分别检测沉默ATF5表达后的细胞活力、凋亡率、紫杉醇敏感性及相关蛋白表达。结果 ATF5-siRNA组ATF5表达显著低于空白组(P0.05)。ATF5-siRNA组A549细胞活力明显降低,细胞凋亡率明显升高,增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达明显降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)3蛋白表达显著升高,细胞对紫杉醇敏感性显著升高,多药耐受相关蛋白基因(MRP)1蛋白表达明显降低,与空白组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。结论利用siRNA沉默ATF5基因表达可抑制A549细胞活力,诱导细胞凋亡,增强紫杉醇敏感性,机制可能与下调PCNA和MRP1表达,上调Bax和cleaved caspase3表达有关。     

miR-21对急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响及机制

目的探讨miR-21对急性胰腺炎(AP)腺泡细胞凋亡的影响及其机制。方法以雨蛙素处理大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,构建AP模型;酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞中淀粉酶(AMY)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6检测造模情况。采用RT-PCR检测miR-21的表达;以脂质体转染miRNA-21 inhibitor后,流式细胞仪检测AR42J细胞凋亡,Western印迹检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切caspase)-3与第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白的表达。结果雨蛙素处理后,AR42J细胞中AMY、TNF-α和IL-6的表达均升高,建模成功。miR-21在AP环境下低表达,转染miRNA-21 inhibitor后,由雨蛙素诱导的细胞凋亡明显受到抑制,PTEN蛋白表达上调,酶切caspase-3蛋白表达下调。结论 miR-21在AP腺泡细胞中低表达,可能通过上调PTEN和下调酶切caspase-3蛋白表达抑制胰腺腺泡细胞凋亡,进而加重胰腺炎的发展。     

miR-181a-5p靶向PIAS1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞损伤的影响

背景急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)引起的急性炎症对人们健康的危害性极大,严重时会危及生命.其发病机制复杂,尚未完全清楚,研究发现miRNA参与了AP的发病过程.研究发现miR-181a-5p可抑制癌细胞迁移、侵袭和血管生成; miR-181a-5p还能抑制胃癌细胞增殖、侵袭,转移和上皮间充质转化.抑制miR-181a-5p表达可通过负向靶向INPP5A抑制细胞增殖和侵袭,增强宫颈癌细胞凋亡. miR-181a可抑制胰腺癌细胞系的生长、减少迁移,增加凋亡.但miR-181a-5p在AP的增殖凋亡中的影响及作用机制尚不清楚.目的研究miR-181a-5p对AP腺泡细胞损伤的影响及潜在的作用机制.方法用100nmol/L的雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡AR42J和MPC-83构建AP模型,设置Con组、Caerulein组、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-181a-5p组(转染miR-181a-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染antimiR-NC)、anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p)、Caerulein+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p后进行Caerulein处)、Caerulein+pcDNA组(转染pcDNA后进行Caerulein处理)、Caerulein+pcDNA-PIAS1组(转染pcDNA-PIAS1后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC组(anti-miR-181a-5p和si-NC共转染后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+siPIAS1组(anti-miR-181a-5p和si-PIAS1共转染后进行Caerulein处理),用脂质体法转染至AR42J和MPC-83细胞.酶联免疫吸附试验法检测雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的TNF-α和IL-6的表达;qRT-PCR检测AR42J和MPC-83细胞中miR-181a-5p、PIAS1mRNA的表达水平; Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞后, TNF-α和IL-6的表达显著升高; miR-181a-5p的表达水平显著升高;PIAS1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低. miR-181a-5p抑制表达和PIAS1过表达抑制TNF-α和IL-6的表达,抑制细胞凋亡. miR-181a-5p靶向负调控PIAS1;抑制PIAS1表达逆转了抑制miR-181a-5p对雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的凋亡抑制作用.结论抑制miR-181a-5p表达可以抑制雨蛙肽诱导的AP腺泡细胞损伤,其机制可能与靶向调控PIAS1有关.可为AP诊断和治疗提供新靶点和新思路.     

青蒿琥酯和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体对前列腺癌细胞凋亡的诱导作用

目的探讨青蒿琥酯和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导前列腺癌细胞(PC-3、LNCaP)凋亡的机制。方法培养前列腺癌PC-3、LNCaP细胞,分别加入青蒿琥酯和TRAIL,随机分为4组,对照组、TRAIL组、青蒿琥酯组、TRAIL+青蒿琥酯组,分别采用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞内相关信号分子(caspase-3/caspase-8、Bcl-2、Bax、Bak)在mRNA及蛋白水平的表达。结果促凋亡基因(caspase-3/caspase-8、Bax、Bak)mRNA及蛋白的表达与TRAIL及青蒿琥酯的浓度呈正相关,凋亡抑制基因(Bcl-2)蛋白及mRNA的表达与TRAIL及青蒿琥酯的浓度呈负相关。结论青蒿琥酯和TRAIL诱导前列腺癌细胞(PC-3、LNCaP)凋亡的机制可能是通过上调caspase-3/caspase-8、Bax、Bak等促凋亡基因和下调Bcl-2等凋亡抑制基因来实现的。     

斑蝥素诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨斑蝥素（Cantharidin）对人胰腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法观察斑蝥素对人胰腺癌细胞株SW1990细胞增殖的抑制作用。采用Hoechst33258染色、TUNNEL染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变，并以RT—PCR和Westernblot检测凋亡调节基因p53和Bcl-2、Bax的表达。结果 5mol／L斑蝥素能明显抑制人胰腺癌SW1990细胞的生长，呈现凋亡特征。RT—PCR和Westernblot检测可见Bax、p53基因表达显著增加，而Bcl—2基因表达减少。结论 斑蝥素能诱导人胰腺癌细胞凋亡，其作用可能与上调p53、Bax基因和下调Bcl-2基因有关。     

Severe acute pancreatitis and reduced acinar cell apoptosis in the exocrine pancreas of mice deficient for the Cx32 gene

BACKGROUND & AIMS: The early events leading to acinar cell injury during acute pancreatitis are poorly characterized. Signaling through gap junction channels contributes to the homeostasis of the exocrine pancreas by coordinating acinar cell activity within an acinus. To explore the role of gap junctional communication in acinar cell response to injury, we analyzed the course of acute pancreatitis induced by injection of cerulein in mice deficient for Cx32, the major gap junction protein expressed in the exocrine pancreas. METHODS: The severity of pancreatitis was evidenced by measuring serum amylase activity, pancreatic edema, acinar cell necrosis, pancreatic tumor necrosis factor alpha concentration, and myeloperoxidase activity. Acinar cell apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL), caspase-3 activity, and Bax/Bcl-2 expression. Expression and function of connexin were evaluated by immunofluorescence and dye coupling. RESULTS: Cx32-deficient mice exhibited a deleterious course of acute pancreatitis with increased necrosis, edema, and inflammation of the exocrine pancreas. In addition, the exocrine pancreas of Cx32-deficient mice showed a decreased number of TUNEL-positive acinar cells and decreased caspase-3 activity but no change in Bax or Bcl-2 pancreatic expression. Interestingly, chemicals known to induce apoptosis in vivo had no effect on Cx32-deficient pancreatic acinar cells. CONCLUSIONS: Deficiency of a pancreatic connexin converts a mild reversible form of acute pancreatitis into a severe disease and decreases the sensitivity of acinar cells to apoptotic stimuli. The results show that acinar cell-to-cell communication plays a key role in the modulation of severity of acute pancreatitis.     

Gli-1 siRNA induced apoptosis in Huh7 cells

AIM： To investigate the effects of Gli-1 small interference RNA （siRNA） on Huh7 cells, and the change of Bcl-2 expression in Huh7 cells. METHODS： Human hepatocellular carcinoma cells Huh7 were used. Cell viability was analyzed by 3-（4, 5-Dimethylthiazol-2-yl）-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide （MTT） assay. The expressions of Gli-1 and Bcl-2 family members were detected by RT-PCR and Western blot. Apoptosis was detected by Flow cytometry using propidium iodide, measured by Hoechst 33258 staining using Advanced Fluorescence Microscopy and caspase-3 enzymatic assay. Cell growth was analyzed after treatment with Gli-1 siRNA and 5-fluorouracil （5-Fu）. RESULTS： Inhibition of Gli-1 mRNA in Huh7 cells through Gli-1 siRNA reduced cell viability. Gli-1 siRNA treatment also induced apoptosis by three criteria, increase in the sub-G1 cell cycle fraction, nuclear condensation, a morphologic change typical of apoptosis, and activation of caspase-3. Gli-1 siRNA was also able to down-regulate Bcl-2. However, Gli-1 siRNA resulted in no significant changes in Bcl-xl, Bax, Bad, and Bid. Furthermore, Gli-1 siRNA increased the cytotoxic effect of 5-Fu on Huh7 cell. CONCLUSION： Down-regulation of Bcl-2 plays an important role in apoptosis induced by Gli-1 siRNA in HCC cells. Combination Gli-1 siRNA with chemotherapeutic drug could represent a more promising strategy against HCC. The effects of the strategies need further investigation in vivo and may have potential clinical application.     

siRNA沉默APE1／Ref-1基因增强人胰腺癌细胞株对吉西他滨的敏感性

背景：人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子-1（APE1／Ref-1）基因与肿瘤的化放疗抵抗和预后密切相关．是肿瘤基因治疗的理想靶点。目的：以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株APE1／Ref-1基因,观察该方法对细胞增殖和凋亡的影响及其能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。方法：将靶向APE1／Ref-1基因的小干扰RNA（siRNA）转染人胰腺癌细胞株SW1990,半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测APEl／Ref-1基因和蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪和Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况。结果：转染APE1siRNA后．SW1990细胞APE1／Ref-1mRNA和蛋白表达显著减低,蛋白表达抑制率为55．4％±3．6％;24h、48h和72h时细胞增殖抑制率分别为41．7％±2．8％、24．8％±3．7％和21．3％±9．8％：吉西他滨组、si-APE1组和联合组均可见明显细胞凋亡．联合组早期凋亡率显著高于两者单用和空白对照组（19．8％±3．5％对7．7％±1．1％、8．4％±1．0％和2．7％±1．4％．P〈0．05）,凋亡核形态学变化最为明显。结论：沉默APE1／ReG1基因能抑制SW1990细胞增殖,促进细胞凋亡,显著提高细胞对吉西他滨的敏感性。RNAi沉默APE1／Ref-1基因联合吉西他滨化疗可能成为胰腺癌治疗的新的选择。     

Staurosporine诱导乳鼠心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax的关系

目的 探讨staurosporine（STS）诱导心肌细胞凋亡过程中,凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化及意义。方法 以STS诱导原代培养的SD乳鼠心肌细胞,检测半胱天冬蛋白酶(caspase)-3的活性及用Hoechst-33258荧光染色观察细胞凋亡。用免疫印迹法（Western blot）检测Bcl-2和Bax表达的变化。用免疫荧光共聚焦显微镜和免疫印迹法观察Bax在细胞内的分布。结果 以4 μmol/L STS处理心肌细胞,随着处理时间的延长,细胞中caspase-3的活性逐渐增加,与对照组比较,8 h达到峰值（P<0.01）。Hoechst-33258荧光染色显示,多数细胞核呈现核分叶。STS诱导心肌细胞凋亡过程中,Bcl-2和Bax的水平与对照组比较无显著变化。正常细胞内的Bax均匀分布于细胞质中,在STS处理的细胞中,Bax明显聚集于线粒体上,呈现明显的线粒体的转位。STS诱导心肌细胞凋亡过程中,胞质片段Bax的水平明显下降,而线粒体片段Bax的水平明显升高,进一步证实STS诱导细胞凋亡过程中伴有明显的Bax线粒体转位。结论 STS诱导细胞凋亡中,伴有明显的Bax由胞质向线粒体的转位。     

加贝酯预防急性胰腺炎的作用机制研究

目的通过观察加贝酯对胰腺细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响,探讨加贝酯预防大鼠胰管注射法诱导的急性胰腺炎(AP)的相关机制。方法16只SD大鼠随机分为假手术组(4只)、AP组和加贝酯治疗组(各6只)。以50mmHg(1mmHg=0.133kPa)的恒压向胰胆管内注入30%泛影葡胺诱导SD大鼠AP模型,制模前15～20min加贝酯(4mg.h-1.kg-1体重)静脉持续滴注60min进行预防。组织病理检查观察胰腺炎症程度,应用TUNEL染色、免疫组化检测胰腺细胞凋亡和Bcl-2、Bax蛋白表达。结果加贝酯治疗组的胰腺组织病理改变较AP组减轻(P<0.05)。治疗组凋亡指数(AI)、Bax和Bcl-2表达值分别为8.00±1.80,10.12±1.52和1.83±0.39,前两者较AP组显著增高,而Bcl-2蛋白无显著差别。治疗组AI、Bax表达与胰腺的炎症程度呈负相关。结论加贝酯静脉滴注对大鼠胰管注射法诱导的AP有一定的预防作用。其机制可能与促进细胞凋亡和Bax蛋白表达上调有关。     

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达,观察其对细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA,转染胰腺癌细胞PANC1.设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组.实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞的增殖率;ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性;Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 与未转染组相比,shRNA组转染后48 h,PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%;细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%;caspase-3和caspase-9酶活性显著增高;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达,其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关.     

RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制

目的:探讨RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制.方法:利用Lipofectamine TM2000转染DNMT1-siRNA至胰腺癌细胞BxPC-3.实验共分为3组:实验组(转染DNMT1-siRNA)、阴性对照组(转染negative-siRNA)和空白对照组(转染脂质体).转染48h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞体外增殖活力;FCM法检测细胞凋亡;甲基化特异性PCR法(MSP)检测抑癌基因p16、RASSF1A和ppENK的启动子甲基化状态.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.01);实验组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(44.46%±5.98%vs3.74%±1.02%vs5.07%±1.16%,P<0.01).空白对照组与阴性对照组的p16、RASSF1A和ppENK基因甲基化阳性,而实验组的p16和ppENK基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化.结论:DNMT1基因表达下调后,能抑制胰腺...     

塞来昔布对大鼠胰腺腺泡细胞炎症损伤的作用

背景：急性胰腺炎（AP）的发病始于胰腺腺泡细胞内胰酶的激活,造成腺泡细胞损伤。环氧合酶-2（COX-2）和核因子-κB（NF．KB）在AP的炎症反应中起重要作用。目的：观察雨蛙肽和选择性COX-2抑制剂塞来昔布对离体大鼠胰腺腺泡细胞COX-2和NF—κB表达的影响．探讨塞来昔布对腺泡细胞炎症损伤的作用。方法：分离大鼠胰腺腺泡细胞,分为对照组、雨蛙肽组（1×10^-7mol／L）和塞来昔布干预组（100μmol／L,15min后加入雨蛙肽）,分别培养1、3、6、12h。测定腺泡细胞活力、淀粉酶分泌率和乳酸脱氢酶（LDH）漏出率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学染色检测COX-2、NF—κBmRNA和蛋白表达。结果：与对照组相比,雨蛙肽组各时间点腺泡细胞活力均显著降低,淀粉酶分泌率和LDH漏出率显著增高,COX-2和NF—κBmRNA表达量显著增高,蛋白表达阳性率亦增加（P〈0．05）。塞来昔布干预组各时间点腺泡细胞活力、淀粉酶分泌率和LDH漏出率均较雨蛙肽组显著改善（心O．05）,COX-2mRNA和蛋白表达显著降低（P〈0．05）,NF—κBmRNA和蛋白表达与雨蛙肽组无明显差异。结论：塞来昔布可抑制大鼠胰腺腺泡细胞中雨蛙肽刺激的COX-2活性,从而减轻细胞炎症损伤。