盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术，采用抑制性PCR，从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因，并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp，由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74％，不一致区主要集中在5’端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶侧翼调控序列的克隆与分析

研究表明八氢番茄红素合成酶( PSY)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素代谢途径中的第一个关键调节酶.本实验采用基于LAoPCR的基因组步移法分别设计两组基因特异引物pSP1-3及tSP1-3,克隆巴氏杜氏藻PSY( DbPSY)的启动子和终止子序列,并利用在线启动子分析软件分析其保守调控序列.最后利用生物信息学方法分析预测DbPSY的蛋白质结构.分析结果表明,DbPSY启动子具有两个保守调控序列:BOXLCOREDCPAL和GT1GMSCAM4,其中BOXLCOREDCPAL受紫外光诱导,上调下游基因的表达,GT1GMSCAM4受盐调控,促进下游基因的表达.蛋白结构分析表明,DbPSY的N端在邻近物种间具有较大的多样性.我们推测DbPSY的微调与启动子保守序列及蛋白质N端序列的多样性相关.     

盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA的分离及序列分析

采用5’和3’RACE技术和梯度PCR方法从盐藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶(Pds)全长cDNA,序列分析表明,该cDNA长2198bp,包含1个1752bp的开放阅读框(ORF),编码一段583氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明,它与高等植物和蓝藻的八氢番茄红素脱氢酶序列一致性高达67%,而与细菌和酵母的序列同源性较差;在N端具有一段转运序列和辅助因子结合结构域,C端则有一胡萝卜素结合域。这些序列特征预示,盐藻Pds与其他绿藻、高等植物和蓝藻中的同源基因一样催化八氢番茄红素发生前2步脱氢反应,并且需要与另一个脱氢酶联合作用合成番茄红素。     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。     

盐藻番茄红素β-环化酶全长cDNA的克隆及结构分析

杜氏盐藻是迄今为止工业化最成功的藻类之一,主要特征是能累积大量的β-胡萝卜素,是β-胡萝卜素最好的天然资源。番茄红素β-环化酶是催化番茄红素合成β-胡萝卜素的关键酶。为阐明该酶在盐藻中合成β-胡萝卜素的作用和调控过程,本研究采用RT-PCR结合半巢式PCR方法,首先分离一段包含辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点的保守序列,再利用3'RACE、5'RACE方法结合降落PCR,获得盐藻番茄红素β-环化酶(LycB)cDNA的两个末端。完整的cDNA全长2475bp,ORF长1824bp,编码607个氨基酸,其编码蛋白的分子量为67kD,等电点pI为8.45。经分析,盐藻番茄红素β-环化酶在系统进化上介于蓝藻和植物之间,但更靠近高等植物,故将此酶标记为LycB。     

白菜型油菜八氢番茄红素合酶基因BrPSY的克隆与序列分析

八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成途经的第一个关键限速酶,对类胡萝卜素合成起着重要的控制作用。本研究利用电子克隆技术,从油菜EST数据库中找到与拟南芥PSY,基因高度同源的油菜EST序列,通过人工拼接及lit—PCR、RACE的方法,克隆得到白菜型油菜BrPSY基因全长eDNA的序列,提交GenBank,被命名为BrPSY（GenBank登记号EUl38883）。BrPSY包含168bp的5’前导序列、69bp的3’不翻译序列和1278bp的完整开放读码框（ORF）,编码47．6kOa的蛋白质。序列比对结果表明,BrPSY蛋白与其它植物的PSY蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,BrPSY与拟南芥亲缘关系最近。在全长eDNA序列的基础上,设计引物从白菜型油菜DNA中克隆得到BrPSY基因的全长DNA序列,含有7个外显子和6个内含子。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

巴氏杜氏藻番茄红素β-环化酶基因的克隆及其启动子的活性分析

杜氏盐藻是迄今为止工业化生产β-胡萝卜素最成功的经济微藻之一,番茄红素β-环化酶(LycB)是催化番茄红素合成β-胡萝卜素的关键酶。本研究根据实验室克隆得到的LycB的cDNA序列,通过分析其保守序列设计引物,通过分段克隆PCR及基因组步移的方法,克隆获得几乎完整的LycB基因组序列。测序结果表明,克隆到的该部分LycB基因组序列含有5863 bp,由11个外显子和10个内含子组成。再通过基因组步移的方法,获得LycB基因启动子和终止子序列。其中,5’端上游序列长度为2566 bp,3’端下游序列长度为818 bp。采用PlantPAN在线启动子预测工具进行分析,结果表明,该基因启动子含有一些顺式作用元件如光响应元件、盐响应元件等,表明巴氏杜氏藻LycB基因的表达可能受到光照及盐浓度等因素的调控。     

盐藻粉及盐藻粉软胶囊的研究开发

文章介绍了盐藻粉及其软胶囊的生产方法、食用安全性、功能及产品标准。动物试验表明盐藻粉软胶囊具有抗辐射、抑制肿瘤和免疫调节的保健功能。该项成果对我国盐田生物技术的发展起到了很大促进作用     

盐藻中类胡萝卜素的高效液相色谱分析

采用Nova PakC18和Bond PakC18两种色谱柱对盐藻中的类胡萝卜素进行了高效液相色谱分析和比较,结果表明在流动相、流速、温度、检测波长等相同的条件下,Bond PakC18对盐藻中类胡萝卜素的分离效果明显好于Nova PakC18。对Bond PakC18分析结果进行了定性分析,初步确定盐藻含有的类胡萝卜素有16种以上。     

Dunalidlla bardawil中类胡萝卜素的高效液相色谱分析及其与Dunaliella salina的比较

采用Bood-Pak C18和Nova-Pak C18两种色谱柱对Dunaliella bardewil中的类胡萝卜素进行了高效液相色谱分析和比较,结果表明在相同的实验条件下,Bood-Pak C18对盐藻中类胡萝卜素的分离效果明显好于Nova-Pak C18。对Bond-Pak C18分析结果进行了定性分析,初步确定Dunaliella bardawil含有的类胡萝卜素有14种以上。同时进行了Dunaliella bardewil和Dunaliella salina类胡萝卜素的比较,表明两种藻主要的类胡萝卜素的成分和含量非常接近,色谱图相似程度很高。     

超声波辅助提取杜氏盐藻油脂工艺研究

对杜氏盐藻油脂的超声波提取工艺进行了研究,采用响应面分析法分析了液固比、超声时间和超声温度对盐藻油脂得率的影响,并建立了相应的预测模型。方差分析的结果表明,液固比、超声温度和超声时间对油脂得率都有显著影响(P<0.005),液固比的二次方项(P<0.005)和超声温度的二次方项(P<0.01)对油脂得率有显著影响,并且超声温度和时间存在交互作用(P<0.05),考虑到提取效率、成本和可行性,利用约束复合形法对结果进行优化,得到的最佳工艺参数为:在选用丙酮为提取溶剂的条件下,液固比29∶1 mL/g、超声时间47 min、超声温度48℃。在最佳工艺参数下,盐藻油脂得率为16.03%,与预测结果相符。     

硝基芳烃类物质对盐藻生长阻碍联合毒性试验及比较

通过国际经济合作与发展组织(OECD)藻类生长抑制实验的国际标准方法,参照《生活饮用水卫生标准》GB5749-85设置毒物浓度进行实验,得到了2,4-二硝基苯胺、2,4-二硝基氯苯、间二硝基苯等三种硝基芳烃类物质两两混合和三者混合共四种不同情况对盐藻(Dunaliella salina)的48h半数有效抑制浓度EC50值,得到各混合物毒性相加和S与联合效应相加指数AI,由其AI值均在-0.1~0.1可知,其混合有相加作用。     

盐藻多糖提取工艺研究

目的探讨盐藻多糖提取工艺流程。方法应用均匀设计实验确定优化提取条件。结果最终确定的条件为20倍水,pH值8,90℃水浴,提取10 h。同法提取2次,每次平行做2份,盐藻多糖得率为22.7%。结论均匀设计的结果与实际相吻合,为今后盐藻多糖的开发利用提供依据。     

硼对盐藻生长与物质积累的调控作用

实验研究了不同浓度的硼对盐藻细胞生长与物质积累的调控作用.结果表明,培养液中供给硼过多或过少都不利于盐藻细胞的生长与物质积累.以培养基中4 mg/L的硼浓度对盐藻细胞生长、蛋白质合成与β-胡萝卜素积累的促进作用最大.这一硼浓度可用于盐藻的生产性培养.当培养液中硼浓度较高(8 mg/L)或较低(2 mg/L)时,单个盐藻细胞中的蛋白质与β-胡萝卜素含量较高.但此时,因培养液中细胞密度较低,盐藻细胞积累的物质总量仍然较少.在硼浓度较高或较低的逆境条件下,盐藻可能通过适应性反应形成了逆境蛋白质与胡萝卜素等.     

国内杜氏盐藻综合利用的现状及发展趋势

文章从盐藻与生物柴油、β-胡萝卜素、盐藻多糖以及生物反应器等四个方面总结了目前国内针对盐藻的研究现状,并对未来的发展方向进行了展望.