KDR靶向RNA干扰对MCF一7细胞凋亡的影响

目的：研究KDR靶向RNA干扰对MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法：采用阳离子脂质体Lipofecta．mine2000TM作为转染试剂将人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱RNAi,采用Hoechst33258染色和半定量RT—PCR检测Caspase-3、survivin的mRNA表达及细胞凋亡变化;比色法检测Caspase．3的活性;利用免疫组织化学方法检测survivin的表达,并用图像分析仪分析蛋白表达强度。结果：靶向KDR的siRNA转染MCF-7后,Caspase-3的mRNA表达上调,survivin基因mRNA及蛋白表达水平下调（P〈0．05）。结论：KDRsiRNA通过减少乳腺癌细胞survivin的表达,增加Caspase．3表达来促进肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤作用。     

应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突状细胞的影响

为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）对树突状细胞（dendritic cell, DC）功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA（small interfering RNA, siRNA),采用脂质体转染法以100 nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞（siRNA组）,以脂质体Lipofectamine　2000TM转染MCF-7 乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照（对照组）,采用ELISA法检测经siRNA 干扰VEGF基因后的MCF-7 乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量, Western 印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC 诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降（P＜0.01）.转染前后DC 诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异（P＜0.01）.由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.     

靶向VEGF小干扰RNA协同5-FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

探讨慢病毒介导的靶向VEGF小干扰RNA联合应用化疗药物5 FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。以携带VEGF siRNA的慢病毒载体感染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组VEGF mRNA、VEGF蛋白及凋亡相关蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,慢病毒VEGF siRNA干扰组细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,凋亡相关蛋白P53及P21表达上调,而SIRT1、Bcl-2及Survivin表达下调。流式细胞术检测显示慢病毒干扰组及5-FU组细胞凋亡率显著升高,联合治疗组的协同作用更为明显。上述结果表明：慢病毒介导的RNA干扰能明显抑制MCF-7细胞VEGF的表达,通过下调SIRTI蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2和Survivin的表达,从而诱导MCF-7细胞的凋亡,并且提高了MCF-7对5-FU的敏感性。     

抑制VEGF基因表达对大肠癌细胞HT-29的增殖影响

选择血管内皮生长因子（VEGF）基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA．合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人大肠癌细胞系HT-29为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．MTT法检测siRNA对细胞增殖率的影响,RT—PCR法比较转染前后VEGFmRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果表明,两组siRNA转染后均能有效地抑制HT-29细胞的生长,VEGF mRNA的表达量大幅度减少;相对应的VEGF蛋白水平也显著降低,而作为阴性对照的错义序列组siRNA转染后则无上述作用．     

RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响

利用pSUPER质粒作为载体,在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达,建立了稳定转染pSUPER—shVEGF1,pSUPER—shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT—PCR证实了在JAR细胞株中,VEGF基因的表达被抑制．显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化,提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用．     

RNA干扰抑制血管内皮生长因子介导结肠癌细胞凋亡

目的应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并通过体外实验,观察VEGF受抑制后,凋亡情况的变化,为RNA干扰技术的临床应用奠定基础。方法通过Tunel和流式细胞计数的方法,观察VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率的变化。结果Tunel和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。结论Tunel和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。     

敲减血管内皮生长因子受体-2表达抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长

应用化学修饰的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)抑制裸鼠乳腺癌移植瘤血管内皮生长因子受体-2基因（VEGFR2,又称kinase insert domain-containing receptor, KDR)的表达, 探讨抑制肿瘤血管生成对人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长的影响．雌裸鼠皮下种植MCF 7 细胞,肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照组（A）、转染试剂对照组（B）、小剂量治疗组（C）及大剂量治疗组（D）．肿瘤局部分别注射葡萄糖溶液、In vivo jetPEI^TM转染试剂和In vivo jetPEI^TM转染试剂包裹的KDRsiRNA．22 d后处死全部动物, 取肿瘤, 测其大小及重量, HE 及免疫组化染色,微血管密度计数,同时用RT-PCR检测KDR基因的表达水平．结果显示,siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;HE染色显示,治疗组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死;免疫组化结果显示,染色阳性血管数明显低于对照组;同时RT-PCR结果表明,治疗组KDR表达下调．对照组各指标无显著变化．因此,化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤血管中KDR 表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗新方法．     

敲减VEGFR-1基因抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的:体外水平探讨利用化学修饰的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减VEGFR-1基因治疗乳腺癌的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质Lipofectamine2000TM作为转染试剂将同时针对人和大鼠VEGFR-1基因的小干扰RNA转染人乳腺癌细胞系MCF-7和大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88,敲减VEGFR-1基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,半定量RT-PCR,蛋白印迹试验等检测VEGFR-1mRNA和蛋白表达及细胞增殖变化.结果:靶向VEGFR-1基因的siRNA转染细胞后,两种细胞增殖均被抑制,同浓度两细胞株指标无显著差异,VEGFR-1mRNA和蛋白的表达均明显降低.各对照组指标则无显著变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi能成功敲减VEGFR-1基因的表达、抑制乳腺癌细胞增殖.     

RNA干扰体内导入技术研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种发展迅速并具有广阔应用前景的基因控制技术,它能特异性地沉默内源或外源性靶基因,已成为基因治疗的有效手段。然而,利用RNA干扰技术进行体内基因沉默的主要障碍是如何实现siRNA和miRNA的体内安全高效输送导入。该文结合国内外进展和本课题组在RNA干扰方面的研究成果,对RNA干扰体内导入技术作一综述。     

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法 将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,观察VEGF表达受抑的程度。结果 成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论 针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。     

干扰小RNA序列非依赖性地影响胰腺癌细胞的基因表达

干扰小RNA(small interference RNA, siRNA)是基因敲减的常用工具,广泛用于基因沉默技术和基因功能研究,在临床疾病治疗等方面也有潜在的应用。一般认为,达到一定长度（比如大于27 bp）的双链RNA可以诱导干扰素反应,降低相关基因的表达。目前,siRNA对基因表达的非特异性作用尚不完全清楚。为研究siRNA干扰的非特异基因表达,本研究以胰腺癌细胞HPAC 和BxPC3 为模型,采用高通量测序技术对6种不同干扰小RNA处理及未作处理的HPAC和BxPC3细胞进行转录组测序分析,筛选出干扰小RNA处理后表达量共同下调的基因进行研究。通过生物信息学方法对表达下调基因的功能进行研究,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分下调基因进行验证。结果表明,短片段双链小RNA能够显著改变细胞的基因表达,而这些基因表达谱的变化是有规律的,特定功能的基因优先发生变化。在表达下调的基因中,某些特定类型的基因变化非常显著,包括氨基酸代谢相关基因、Hedgehog信号途径基因和多巴胺受体D5基因等。这些结果表明,在使用siRNA时需要考虑其序列非依赖性地基因表达调控作用。     

siRNA对乳腺癌细胞Cyclin E表达和生长抑制作用

研究siRNA对乳腺癌MCF-7细胞株cyclin E表达的抑制及对细胞生长的影响。化学合成针对cyclin E基因的小干扰RNA（siRNA）,转染MCF-7细胞株;分别应用荧光定量PCR和免疫印迹测定cyclin E mRNA和蛋白质的表达,CCK-8测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,软琼脂培养检测细胞克隆形成能力。10、50、100nmol／L siRNA-cyclin E分别使MCF-7细胞cyclin E基因表达降低了24．7％、62．5％和71．0％,蛋白质表达降低了40．8％、66．5％和71．3％。转染siRNA-cyclin E后,G1期细胞增多,S期减少,增殖受到抑制,软琼脂克隆形成率降低。结果提示,在MCF-7细胞株中,导入针对cyclin E的siRNA,可有效抑制cyclin E的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型。     

综述: 适配子介导的siRNA转运

小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)因能快速抑制哺乳动物特定基因的表达而用于各种疾病的治疗,然而选择合适的载体将siRNA安全有效地转运进入靶细胞仍是制约siRNA应用于临床治疗的重要因素．越来越多的转运载体被开发出来,其中包括针对细胞表面蛋白的适配子(aptamer)．Aptamer是一种能与靶分子高特异性和高亲和结合的寡核苷酸,已经越来越多地用于疾病的诊断和治疗．Aptamer作为载体介导siRNA转运可提高治疗的靶向性并减少副作用,这将为siRNA应用于临床靶向治疗提供一种特异有效的途径．目前,已经发现几种aptamers可以介导siRNA的转运,如anti-PSMA aptamer,anti-HIV gp120 aptamer,anti-CD4 aptamer等．本文将综述aptamer介导siRNA转运的最新研究进展．     

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提     

Expression of Epidermal Growth Factor Receptor Detected by Cetuximab Indicates Its Efficacy to Inhibit In Vitro and In Vivo Proliferation of Colorectal Cancer Cells

Cetuximab is a chimeric mouse–human monoclonal antibody that targets the human epidermal growth factor receptor (EGFR). However, EGFR expression determined by immunohistochemistry does not predict clinical outcomes of colorectal cancer (CRC) patients treated with cetuximab. Therefore, we evaluated the correlation between EGFR levels detected by cetuximab and drug sensitivities of CRC cell lines (Caco-2, WiDR, SW480, and HCT116) and the A431 epidermoid carcinoma cell line. We used flow cytometry (FCM) to detect EGFR-binding of biotinylated cetuximab on the cell surface. Subcloned cell lines showing the highest and lowest EGFR expression levels were chosen for further study. Cytotoxic assays were used to determine differential responses to cetuximab. Xenograft models treated with cetuximab intraperitoneally to assess sensitivity to cetuximab. Strong responses to cetuximab were specifically exhibited by subcloned cells with high EGFR expression levels. Furthermore, cetuximab inhibited the growth of tumors in xenograft models with high or low EGFR expression levels by 35% and 10%–20%, respectively. We conclude that detection of EGFR expression by cetuximab promises to provide a novel, sensitive, and specific method for predicting the sensitivity of CRC to cetuximab.     

siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

以HCVIRES为靶位 ,应用T7RNA多聚酶体外转录合成了 5条小干扰RNA(siRNA) .脂质体转染法将其导入HCVIRES介导萤光素酶表达的转基因细胞 (HepG2 .970 6 )中 ,通过测定萤光素酶的量 ,评价T7siRNA对HCV介导基因表达的抑制作用 .结果表明 ,所合成的 5条T7siRNAs ,均能特异性地抑制萤光素酶基因的表达 ,抑制率分别为 94 31%、80 0 1%、78 0 1%、80 33%、85 6 4% ,其中以靶向HCVIRES第二茎环结构的T7siRNA1抑制率最高 ,且对HCV基因的抑制作用有剂量依赖性 ,随T7siRNA1量的增加 ,抑制率逐渐增强 .siRNA抑制HCV基因的作用具有良好的特异性 ,改变其中 1个核苷酸即无显著抑制作用 .     

New Castanospermine Glycoside Analogues Inhibit Breast Cancer Cell Proliferation and Induce Apoptosis without Affecting Normal Cells

sp²-Iminosugar-type castanospermine analogues have been shown to exhibit anti-tumor activity. However, their effects on cell proliferation and apoptosis and the molecular mechanism at play are not fully understood. Here, we investigated the effect of two representatives, namely the pseudo-S- and C-octyl glycoside 2-oxa-3-oxocastanospermine derivatives SO-OCS and CO-OCS, on MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer and MCF-10A mammary normal cell lines. We found that SO-OCS and CO-OCS inhibited breast cancer cell viability in a concentration- and time-dependent manner. This effect is specific to breast cancer cells as both molecules had no impact on normal MCF-10A cell proliferation. Both drugs induced a cell cycle arrest. CO-OCS arrested cell cycle at G1 and G2/M in MCF-7 and MDA-MB-231cells respectively. In MCF-7 cells, the G1 arrest is associated with a reduction of CDK4 (cyclin-dependent kinase 4), cyclin D1 and cyclin E expression, pRb phosphorylation, and an overexpression of p21^Waf1/Cip1. In MDA-MB-231 cells, CO-OCS reduced CDK1 but not cyclin B1 expression. SO-OCS accumulated cells in G2/M in both cell lines and this blockade was accompanied by a decrease of CDK1, but not cyclin B1 expression. Furthermore, both drugs induced apoptosis as demonstrated by the increased percentage of annexin V positive cells and Bax/Bcl-2 ratio. Interestingly, in normal MCF-10A cells the two drugs failed to modify cell proliferation, cell cycle progression, cyclins, or CDKs expression. These results demonstrate that the effect of CO-OCS and SO-OCS is triggered by both cell cycle arrest and apoptosis, suggesting that these castanospermine analogues may constitute potential anti-cancer agents against breast cancer.     

大豆异黄酮激活PPARγ抑制人乳腺癌MCF-7 细胞增殖

目的:探讨两种大豆异黄酮主要成分染料木黄酮(genistein,GEN)和大豆苷元(daidzein,DAI)抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用与过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)信号途径的关系。方法:采用免疫细胞化学染色方法观察MCF-7细胞的PPARγ表达情况,PPARγ介导的荧光素酶报告基因检测大豆异黄酮和PPARγ配体罗格列酮(rosiglitazone,ROS)对MCF-7细胞PPARγ的激活作用,MCF-7细胞分别经8×10-5mol/L GEN、DAI和1×10-5mol/L的ROS单独或联合1×10-5mol/L的PPARγ特异性抑制剂GW9662联合处理24、48和72 h后,用CCK-8法检测细胞增殖。结果:MCF-7细胞存在有PPARγ表达,GEN、DAI呈剂量依赖性增强报告基因荧光素酶活性,且这种作用可被GW9662明显阻断;GEN、DAI和ROS呈时间依赖性明显抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05),而GW9662可以显著削弱GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞的增殖抑制作用(P<0.05)。结论:大豆异黄酮可通过激活乳腺癌MCF-7细胞的PPARγ信号途径抑制其增殖。