人工感染呼肠孤病毒对拟穴青蟹部分免疫因子的影响

采用注射和浸泡的方式人工感染拟穴青蟹呼肠孤病毒,研究了其对拟穴青蟹血细胞密度以及血清中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）和碱性磷酸酶（AKP）活力的影响.结果表明：注射（第Ⅱ组）和浸泡（第Ⅳ组）方式均能感染健康青蟹,病发死亡时间为7～9 d,死亡率达100%,血细胞平均密度在试验36～72 h间迅速上升并达最高值,其血细胞密度最高值分别为1.4008×107cells/mL与1.8243×107cells/mL;感染病毒的青蟹PO活性均大致呈现下降的趋势,其中,第Ⅳ组感染12 h青蟹PO活性相对对照组显著升高（P〈0.05）,其值为（6.90±1.54）,达实验所测PO活性最高值;各实验组血清SOD活性呈无规律的变化;AKP活性感染组与对照组表现不同.表明测定血细胞密度以及PO和AKP活性可用来辅助诊断青蟹疾病,而SOD活性变化不能很好地表征青蟹受病毒感染的状况.     

盐度变化对锯缘青蟹Scylla serrata免疫因子的胁迫影响

在实验室条件下测定了在盐度5.0,10.0,17.5,25.0,35.0胁迫0,12,24,48,72和96 h,锯缘青蟹血细胞总数(THC)、血细胞吞噬能力及其血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)、溶血素等免疫相关因子的活力变化。结果表明：各梯度盐度胁迫下THC明显下降,其他免疫指标均在12至24 h出现一个峰值变化,而后趋于平稳。在12 h盐度5.0和35.0组吞噬百分比(PP)、吞噬指数(PI)值高于对照组,盐度10.0和25.0组的LZM,PO活力显著高于对照组,除盐度5.0组以外的ACK,APK活力均高于对照组;POD、溶血素活力在盐度10.0和25.0组显示随时间的延续而增高,分别在72和24 h达到最大值,且极显著高于对照组;SOD的变化不显著。说明盐度突变对锯缘青蟹各相关免疫因子均有影响,低浓度短时间的盐度胁迫能引起应激反应,适当提高其免疫力,而大幅度长时间的盐度胁迫可显著影响锯缘青蟹的抗病力。     

拟穴青蟹酚氧化酶原基因的抗菌免疫反应研究

以拟穴青蟹酚氧化酶原(SP-proPO)基因作为研究对象,通过金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌免疫刺激后表达模式的分析,来探索SP-proPO基因在防御细菌入侵过程中的先天免疫作用.结果表明,SP-proPO基因在正常拟穴青蟹的血细胞中存在较高的表达量;而且在细菌刺激的情况下,SP-proPO基因的表达量存在较为明显的上升,哈维氏弧菌刺激12h后,血细胞中SP-proPO基因的表达量提高了近4倍;金黄色葡萄球菌刺激2h后,血细胞中SP-proPO基因的表达量提高了近2.5倍.     

野生和养殖拟穴青蟹营养品质比较分析

取野生和养殖拟穴青蟹(Scylla paramammosain)成蟹各6只(公母各半),分离其肌肉和性腺,进行营养成分分析。结果表明,野生和养殖拟穴青蟹肌肉和性腺中的水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分之间存在显著差异(P<0.05);野生拟穴青蟹和养殖拟穴青蟹肌肉及性腺中检测到的17种氨基酸含量均有差异,野生拟穴青蟹肌肉中呈味氨基酸(FAA)总量均显著低于养殖拟穴青蟹(P<0.05),必需氨基酸(EAA)比例显著高于养殖拟穴青蟹(P<0.05);野生拟穴青蟹和养殖拟穴青蟹肌肉及性腺中脂肪酸的组成也都存在差异,两种拟穴青蟹的脂肪酸组成各有优势。     

拟穴青蟹池塘育苗生物饵料的初步研究

围绕以轮虫、桡足类为饵料系列的拟穴青蟹（Scylla paramamosain）池塘育苗方式替代传统的以轮虫、卤虫无节幼体为饵料系列的工厂化育苗方式,以降低育苗成本这一主题,采用实验室研究与生产性试验相结合的形式,探讨了轮虫、桡足类作为不同发育阶段拟穴青蟹蟤状幼体饵料的效果及其转换时机、适宜密度等与拟穴青蟹池塘育苗相关的技术参数。研究结果表明：在拟穴青蟹池塘育苗中,轮虫和桡足类可以成为拟穴青蟹蟤状幼体至大眼幼体阶段良好的食物源,2种饵料的理想转换期为蟤状幼体Ⅲ期（Z3）阶段;Z3－Z4阶段,3 ind／mL小规格桡足类密度组的幼体平均变态成活率优于其他规格桡足类密度组及卤虫对照组;Z4－M（大眼幼体）阶段,5 ind／mL大规格桡足类密度组的幼体平均变态成活率优于其他规格桡足类密度组及卤虫对照组;通过适当加大饵料密度的方式可以提高小规格桡足类对拟穴青蟹后期幼体（Z4－M）的变态成活率。因此,Z3投喂小规格桡足类,Z4及以后投喂大规格的桡足类,采取人工补充投喂的方式将投喂后的桡足类密度控制在5000 ind／L左右,是拟穴青蟹池塘育苗获得成功的关键。池塘育苗生产性试验共收获大眼幼体20万ind,Z1－M的成活率为13．3％。     

不同饵料对室内立体养殖拟穴青蟹生长与摄食环境的影响

为研究不同饵料对室内立体养殖(蟹公寓)拟穴青蟹生长性能和摄食环境的影响,通过投喂不同饵料(缢蛏、鲜鱼肉、青蟹配合饲料和鳗鱼配合饲料),采用标准方法对青蟹摄食过程中的生长和环境水质参数进行分析。结果显示,特定生长率方面,缢蛏组最高(1.15%·d^-1),鳗鱼饲料组(0.56%·d^-1)次之,同时除缢蛏组外,其他饵料组特定生长率与pH值、溶解氧、氨氮等显著相关。存活率方面,缢蛏组与水质指标均无显著相关性,鱼肉组仅与活性磷酸盐、亚硝氮显著相关,两种人工配合饲料组与活性磷酸盐、悬浮颗粒物、溶解氧、pH值、亚硝氮等指标显著相关。除水温度和盐度外,水质指标主要受饵料投喂的影响。水质综合污染指数显示,摄食过程中4种饵料组均处于污染状态,同时环境富营养化(NQI≥8.5),但缢蛏组富营养化程度最低。研究表明,缢蛏是最优的蟹公寓养殖饵料,其饲喂的青蟹具有较高生长性能,且养殖水体环境更优。综合考虑养殖成本,配合饲料也适于蟹公寓养殖青蟹,但需进一步改善摄食环境水质。研究结果为设施化拟穴青蟹养殖的饵料选择和管理措施优化提供了技术依据。     

拟穴青蟹仔蟹个体发育中的形态变异分析

以采捕于海南省文昌市清澜海区自然交配性成熟母蟹所产子一代为研究对象,运用多元统计分析方法,对人工培育的拟穴青蟹C1～C5期仔蟹的14项形态特征进行了分析。Q型聚类分析结果表明,C4期仔蟹最先和C5期仔蟹聚为一组,随后与C3、C2期仔蟹聚集,最后才和C1期仔蟹聚集,说明随着个体发育仔蟹形态发生了一定的变化,各期仔蟹形态特征之间存在一定程度的差异,但这种形态差异会随着个体发育而趋于缩小。判别分析结果表明,C1～C5期仔蟹的判别准确率分别为100.0%、100.0%、96.7%、69.7%、83.9%,平均拟合概率达到88.7%,判别率比较高,但C3、C4、C5期仔蟹存在一定程度的误判。R型聚类分析结果表明各项形态特征可分为3类,其中一类为全甲宽和第八侧齿间距,一类为甲长、第一侧齿间距及螯足掌节长,其他各项形态特征聚为一类,前2类是青蟹仔蟹形态特征的重要指标。因此,在根据形态评估种质资源、分析种群差异、确立种质标准和研究生长发育时,需综合考虑不同发育阶段与形态特征发育的相关性。     

拟穴青蟹2种地理群体的形态与养殖比较研究

为探明拟穴青蟹(Scylla paramamosain)2个地理群体的形态特征区分和养殖生长性状特征,通过测量形态指标和养殖比较研究,结果表明,浙江宁波和越南2个地方种群青蟹,在甲长/甲宽(CL/CW)、腹部宽/甲宽(AW/CM)、体高/甲宽(BH/CW)、大螯不动指长/甲宽(FFLC/CW)、第一步足长节长/甲宽(MLP1/CW)、第二步足长节长/甲宽(MLP2/CW)、第三步足长节长/甲宽(MLP3/CW)、第四步足指节长/甲宽(MLP4/CW)的比值存在显著差异(P0.05),浙江宁波种群蟹比越南蟹甲长/甲宽(CL/CW)更大,腹部宽/甲大(AW/CM)更大,体高/甲宽(BH/CW)更小,说明甲壳更圆。浙江宁波种群比越南种群生长快,个体大,差异显著(P0.05),养殖成活率也高于越南群体。越南群体青蟹在浙江沿海养殖不具比较优势。     

拟穴青蟹致病性副溶血弧菌分离鉴定及药敏试验

[目的]确定引起拟穴青蟹发病死亡的病原菌,并了解其致病性及药敏特性,为该病的临床诊断及科学防控提供理论依据,同时为保障拟穴青蟹养殖业的健康发展打下基础.[方法]采用常规细菌分离纯化方法从患病拟穴青蟹的病料组织中分离优势菌株,通过形态特征观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列分析进行分类学鉴定,并进行人工感染试验、组织病理学观察及药敏特性分析.[结果]从患病拟穴青蟹肝胰腺中分离得到1株优势菌株(编号NS1SP18),菌株NS1SP18感染拟穴青蟹48 h的半数致死剂量(LD50)为3.18×104 CFU/g,感染发病拟穴青蟹呈现出多体液、偶有黑鳃及肝胰腺暗黄等症状,与自然发病拟穴青蟹的症状相似.综合菌株NS1SP18的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果,可鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus).患病拟穴青蟹的肝胰腺细胞发生变性;心肌纤维肿大,细胞坏死,有血淋巴浸润;网状鳃腔结构消失,脱落细胞阻塞鳃腔;肌纤维形变、断裂,局部坏死.菌株NS1SP18对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素、多四环素、诺氟沙星、复方新诺明和庆大霉素等7种抗生素敏感,对麦迪霉素、万古霉素和阿莫西林已产生耐药性;对诃子、乌梅、苏木和八角茴香等4味中药极敏,对地榆、女贞子、山楂、五倍子、黄连、半枝莲、赤芍和救必应等8味中药高敏,对应的最小抑菌浓度(MIC)为7.81~31.25 mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为15.62~125.00 mg/mL.[结论]从患病拟穴青蟹分离获得的副溶血弧菌具有较强致病性,能造成严重的组织损伤而导致拟穴青蟹发病死亡.在拟穴青蟹养殖生产中,可适度选用氟苯尼考和恩诺沙星等抗生素抑制副溶血弧菌病暴发流行,或以诃子、乌梅、苏木和八角茴香等中药进行副溶血弧菌病防治.     

拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(>50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。     

青蟹野生与养殖群体遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星分子标记对青蟹东海三门湾野生群体和浙江三门养殖群体的遗传多样性进行分析。6个微卫星位点在2个青蟹群体中共检测到66个等位基因,多态信息含量为0.746 ～ 0.895,均表现为高度多态性,可有效应用于青蟹遗传多样性的研究。青蟹野生群体与养殖群体的等位基因数分别为4 ～ 18,6 ～ 14,平均杂合度分别为0.577,0.561,平均多态信息含量分别为0.779,0.828;群体间遗传分化指数FST值为0.0317,遗传相似性指数为0.7930,遗传距离为0.2319。结果表明,青蟹野生与养殖群体的遗传多样性均较丰富,群体间存在一定的遗传分化。     

冬季不同海区锯缘青蟹细胞膜脂肪酸组成比较

通过比较冬季不同海区锯缘青蟹(Scylla paramamosain)细胞膜脂肪酸组成,旨在理解冬季低温对甲壳动物细胞膜脂肪酸组成的影响。利用气相色谱法测定采自厦门和宁海海区锯缘青蟹鳃、肝胰腺和肌肉细胞膜中脂肪酸组成。结果显示:锯缘青蟹鳃和肝胰腺细胞膜中C16∶0和C16∶1在宁海海区显著低于厦门海区(P<0.01或P<0.05);肝胰腺细胞膜中C18∶0在宁海海区显著低于厦门海区(P<0.01);C20∶4在鳃、肝胰腺和肌肉细胞膜中宁海海区均显著高于厦门海区(P<0.01或P<0.05);肝胰腺中C20∶5宁海海区也显著高于厦门海区(P<0.01)。鳃和肝胰腺细胞膜中饱和指数∑SFA/∑UFA宁海海区显著低于厦门海区(P<0.01或P<0.05);肌肉细胞膜中无显著差异(P>0.05)。结果表明:冬季温度较低的宁海海区,细胞膜脂肪酸组成中不饱和脂肪酸增加,饱和指数下降,从而维持细胞膜的流动性和正常生理功能的执行。研究亮点:本研究率先以采自冬季不同海区的锯缘青蟹为研究对象,比较其鳃、肝胰腺和肌肉中细胞膜脂肪酸组成,研究冬季自然低温对青蟹细胞膜脂肪酸组成影响;探讨不同器官组织细胞膜在冬季低温适应上的差异,为青蟹...     

锯缘青蟹血蓝蛋白酚氧化酶活性研究

以锯缘青蟹Scylla serrata为研究对象,运用亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基璜酸钠(SDS)-PAGE、Western-blot以及酚氧化酶活性测定等方法研究了锯缘青蟹血蓝蛋白的酚氧化酶活性以及几种金属离子对其酚氧化酶活性的影响.研究结果表明,锯缘青蟹血蓝蛋白在没有任何诱导物作用的情况下表现出酚氧化酶活性,胰蛋白酶对此活性有轻微抑制作用;与对照组相比,Ca2 和Cu2 能使血蓝蛋白酚氧化酶活性显著增强,增强率分别为281%和273%;EDTA可显著抑制Cu2 对血蓝蛋白酚氧化酶活性的激活作用,抑制率达78.5%.由此可知,锯缘青蟹血蓝蛋白确有酚氧化酶活性,且受Ca2 、Cu2 等金属离子作用的影响.     

玻璃化液对锯缘青蟹不同时期幼体成活率的影响

以海水养殖对象-锯缘青蟹(Scylla serrata)5种不同时期的幼体为实验材料,利用自行配制的6种不同组合的玻璃化液对试验材料进行处理,处理时间分别是0.5 min、1.0 min、3.0 min、5.0 min、7.0 min,统计最终的成活率.结果表明:在6种不同组合的玻璃化液中,随着处理时间的延长,各期幼体的成活率逐渐下降,在不同组合的玻璃化液和不同的处理时间下均以Z3(第三期蚤状幼体)的成活率最好, F号玻璃化液(20%1.2-丙二醇 20%乙二醇)中幼体的成活率最高.     

锯缘青蟹黄水病病原菌的分离与鉴定

[目的]确定锯缘青蟹黄水病致病菌的病原。[方法]对从患黄水病的锯缘青蟹体内分离出的28株致病菌株进行培养、形态鉴定、生理生化鉴定和人工感染等试验。[结果]分离出的菌株均为弧菌科细菌,其中嗜水气单胞菌12株、辛辛那提弧菌8株、副溶血弧菌5株、温和气单胞菌3株。[结论]4种菌株均为青蟹黄水病的病原菌,其中嗜水气单胞菌为优势种群。     

锯缘青蟹血细胞酚氧化酶活力及主要影响因子

研究了温度、pH、促进剂、抑制剂、菌体及免疫多糖对锯缘青蟹(Scylla serrata)血细胞裂解物(HLS)酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活力的影响。试验结果表明:锯缘青蟹PO的最适作用温度为25℃,最适pH值为7.8;SDS、Ca2 、Mg2 均可提高PO的活力,其中Ca2 和Mg2 的最佳反应浓度分别为50 mmol/L和150 mmol/L,SDS的最佳反应浓度为2.5 mg/mL;叠氮钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠、乙二胺四乙酸、Cu2 对PO活力有不同的抑制作用。发现拟态弧菌SS060818、气单胞菌Mr M0602、金黄色葡萄球菌ATCC25923、溶壁微球菌AS1.634对PO有激活作用,其中拟态弧菌和气单胞菌激活作用显著,金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌对PO有弱激活作用;肽聚糖、拟态弧菌脂多糖粗提物可显著提高PO活力,肽聚糖、脂多糖的最佳激活浓度分别为2.7mg/mL、0.5 mg/mL。