乙型肝炎病毒 X 蛋白的功能研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒，其基因组含有4个开放读码框架，分别称为S、C、P和X区。HBV感染过程中产生3．5kb、2．4kb、2．1kb、07kb等4种转录产物；分别编码核心蛋白、S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白及X蛋白（HBx）。HBx基因位于HBV基因组中C基因的上游，长约465个核苷酸，编码154个氨基酸残基的蛋白，具有多种调控功能。     

谷氨酸对星状胶质细胞分泌神经生长因子的影响

星状胶质细胞合成分泌神经生长因子 ( NGF)受到多种因素 (发育过程、神经系统损伤、病毒刺激等 )的影响。其中脑损伤后谷氨酸的作用还不明确〔1〕。通过体外培养星状胶质细胞 ,用不同浓度的谷氨酸直接作用于细胞 ,观察细胞合成分泌 NGF的改变 ,明确了谷氨酸对星状胶质细胞表达 NGF的确切作用。1　材料与方法1 .1　星状胶质细胞的培养纯化鉴定　取 SD乳鼠(生后 3～ 5天 )大脑组织 ,按参考文献〔2〕方法进行培养。1 .2　细胞的分组与处理　纯化后的星状胶质细胞以 2× 1 0 5/ml密度接种于 2 4孔培养板上培养 48h,吸去培养液 ,每组设 4孔 …     

Notch1蛋白-人类HBx相关性肝癌治疗新靶点

肝细胞肝癌(HCC)发病率不断增加,但迄今尚缺乏有效的治疗方法和药物。因此,迫切需要寻找一种有效的治疗方法。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致肝癌的重要原因之一,其中乙肝病毒X蛋白(HBx)是导致肝癌发生的直接原因。我们最近发现HBx可以活化Notch1蛋白从而促进肿瘤生长,而Notch1短发夹RNA(shRNA)可以抑制Notch1表达从而抑制肿瘤的生长。本文综述了近年有关Notch1与HCC的关系,提出HCC基因治疗的新靶点。     

HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响

目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。     

WT1反义寡核苷酸对白血病细胞的抑制作用

造血细胞的增殖受多种因子的调控 ,白血病的发生与基因的异常表达有关。Ｗｉｌｍｓ肿瘤基因(ＷＴ1)位于染色体 11ｐ13,编码一个具有激活和抑制双重功能的转录调控蛋白。ＷＴ1可以作用于许多与造血细胞增殖有关的基因 ,在不同的肿瘤发生和发展过程中起重要作用〔1、2〕。ＷＴ1在成熟细胞中未见表达或表达很低 ,而在大多数白血病细胞中则高度表达 ,且与白血病患者的预后有关 ,表达增高并持续阳性者 ,预后较差 〔3、4〕。本研究应用ＷＴ1反义寡核苷酸 (ＷＴ1ＡＳＯ)封闭白血病细胞ＷＴ1基因的表达 ,然后观察其对白血病细胞增殖的抑制作用 ,以探…     

乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义

乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中存在稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA);④可以整合到宿主细胞染色体DNA中;⑤病毒蛋白对某些宿主细胞基因表达具有反式调节作用.HBV的这些病毒学特点与乙型肝炎的慢性化和疾病进展密切相关.多位点检测HBV RT基因耐药突变对临床监测病毒耐药、合理进行抗病毒治疗十分重要,分析病毒基因组变异和检测cccDNA对深入了解HBV致病机制与疗效评价有积极意义.技术方法 的创新与改进是进行HBV临床病毒学特点研究的基础.     

乙型肝炎病毒e抗原与金属硫蛋白相互作用的研究

乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)被认为与乙型肝炎病毒 (HBV)引起免疫耐受 ,免疫系统功能障碍有关。为探讨HBeAg在乙型肝炎发病机制中的作用 ,寻找防治HBV感染的有效方法 ,应用酵母双杂交系统 3构建HBeAg诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9后 ,与含肝cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交 ,在营养缺陷培养基 (SD/ Trp Leu His Ade)上及X α 半乳糖苷酶 (X α gal)蓝白斑双重筛选与肝细胞蛋白结合的蛋白 ,结果获得真阳性菌落 39个 ,提取酵母质粒转化大肠杆菌 ,测序后进行生物信息学分析 ,发现其中含金属硫蛋白(MT)基因的菌落有 3个。进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实 ,金属硫蛋白与HBeAg间有确切的结合作用。推测金属硫蛋白在HBV的致病过程中起着重要作用     

慢性乙型肝炎患者自然杀伤细胞代谢活性研究进展

慢性乙型肝炎(CHB)是一世界性公共卫生问题.乙型肝炎病毒(HBV)持续性感染的关键是病毒复制环节中形成的闭合环状DNA,现有治疗措施难以将其彻底清除.研究表明,自然杀伤细胞(NK)在HBV慢性持续性感染过程中的表型和功能变化不同于急性感染,提示NK细胞的功能可能与机体能否清除HBV有关.NK细胞作为重要的天然免疫细胞,其发育、分化和活化依赖于代谢活性,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一类与细胞代谢活性高度相关的丝氨酸/苏氨酸激酶,其磷酸化水平决定着NK细胞的代谢活性和功能.本文从HBV的慢性持续性感染、NK细胞的表型和功能、NK细胞发育分化与mTOR的关系等方面进行综述.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1相互作用蛋白的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白.方法 将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆.提取单个阳性文库质粒进行酶切鉴定,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.利用免疫共沉淀方法进一步验证HBVDNAPTP1与成对免疫球蛋白受体α(PILRα)在体外的相互作用.结果 经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的酵母细胞"诱饵"表达质粒,获得了与HBVDNAPTP1具有相互作用的已知功能蛋白4种,分别为PILRα、酶原颗粒蛋白16、羧酸脂酶1、β转导素样蛋白2.免疫共沉淀结果表明HBVDNAPTP1与PILRα在体外存在相互作用.结论 获得了4种可与HBVDNAPTP1相互作用的候选蛋白,HBVDNAPTP1可能参与了肝细胞的增殖分化、信息传递和生长代谢.     

CDC42在HBx介导肝细胞恶性转化中作用的定量蛋白质组学研究

目的寻找在乙肝病毒 X 蛋白（HBx）诱发肝细胞恶性转化过程中 CDC42信号通路发挥作用的介导因子。方法利用基于质量亏损的准等重二甲基标记（pIDL）的定量蛋白质组学方法,检测 CDC42基因敲除前后HBx 转基因细胞蛋白质组的差异。筛选差异蛋白并对差异蛋白进行基因本体（gene ontology,GO）功能分析。结果与结论共定量到3409个蛋白,筛选出220个差异蛋白,通过 GO 分析发现与细胞骨架组织相关的 palladin、成蛋白样亚家族1（formin-like 1,FMNL1）和角蛋白-19均发生显著下调。该研究为 CDC42在 HBx 介导 Huh7细胞恶性转化的机制研究提供了候选基因和蛋白。     

替比夫定与拉米夫定对慢乙肝患者T淋巴细胞亚群的影响

慢性乙型肝炎又称乙型病毒性肝炎,是由乙肝病毒(HBV)感染而引起的一种疾病.乙肝病毒在肝内繁殖复制,但其本身对肝细胞无明显的直接损伤作用,而是病毒诱导机体对其感染形成一种持续免疫耐受状态,从而间接引起肝细胞的坏死,这种免疫反应主要通过细胞因子介导[1].T淋巴细胞亚群的比例失衡及功能异常所导致的组织损伤与乙型肝炎的发病密切相关,是乙型肝炎的发病机制之一[2].     

病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略

乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显著影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 (HCC)发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

抗艾滋病药物研究进展

艾滋病 (AIDS)即人类免疫缺陷综合证 ,HIV是其病原体。HIV属于逆转录病毒科、慢病毒属中的灵长类免疫缺陷病毒亚属〔1,2〕。HIV病毒有 2种 ,即HIV 1和HIV 2 ,其中HIV 1致病常见 ,感染率高 ,传播迅速。HIV基因结构 ,HIV原病毒 (provirus)DNA的基因具有逆转录病毒基本结构的 gag、pol、env基因。gag基因编码结构蛋白 :pol基因编码切断结构蛋白的蛋白酶 (PR)、逆转录酶 (RT)与整和酶 (IN)等颗粒内酶 ,而env基因则编码包装病毒颗粒的包膜蛋白。HIV除以上三种基因外 ,还有辅助基因即病毒所必需的调节基因tat、rev ,以及体外病…     

Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响

目的 探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用.方法 分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞.转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期.结果 转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖最快,转染LV-Tmub 1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖最慢,两组之间差异有统计学意义(P＜0.01).过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2+S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖.     

Notchl蛋白-人类HBx相关性肝癌治疗新靶点

肝细胞肝癌（HCC）发病率不断增加，但迄今尚缺乏有效的治疗方法和药物。因此，迫切需要寻找一种有效的治疗方法。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝癌的重要原因之一，其中乙肝病毒X蛋白（HBx）是导致肝癌发生的直接原因。我们最近发现HBx可以活化Notchl蛋白从而促进肿瘤生长，而Notchl短发夹RNA（shRNA）可以抑制Notchl表达从而抑制肿瘤的生长。本文综述了近年有关Notchl与HCC的关系，提出HCC基因治疗的新靶点。     

阿德福韦、拉米夫定联合治疗拉米夫定耐药乙型肝炎的抗耐药优势

乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，它通过逆转录在肝细胞中进行复制。HBV聚合酶在HBV复制过程中起着重要的作用．已知核苷类药物耐药突变均发生在HBV聚合酶上。与其它DNA聚合酶不同，HBV聚合酶是一种逆转录酶，缺乏校正的功能，同时HBV复制能力强，每日可产生1012～1013个病毒，因此发生突变的概率高，使HBV变异率高于其他DNA病毒10倍左右。核苷类药物主要是通过与HBV聚合酶的天然底物（dNTP）竞争来达到抑制HBV聚合酶的活性，从而达到抑制HBV复制的作用。但是由于它不能清除肝细胞内病毒的环状DNA（cccDNA），未达到血清转换，停药后HBVDNA又可再度复制．所以需长期使用。