MicroRNA-133b抑制人横纹肌肉瘤细胞增殖与迁移的研究

该研究首先通过Real-time RT-PCR检测发现,microRNA-133b在人横纹肌肉瘤细胞RD和A204中的表达量比正常肌肉组织中的表达量明显降低,再通过阳离子脂质体介导的方法将microRNA-133b转染入横纹肌肉瘤细胞RD和A204细胞中,并应用MTS法、Transwell法研究发现,microRNA-133b可明显抑制RD和A204细胞的增殖与迁移;采用Western blot法检测转染后细胞内与增殖、迁移及细胞周期相关的蛋白表达,发现microRNA-133b能下调RD和A204细胞中的LIMand SH3 protein 1（LASP1）、c-MET、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2、p-Rb的表达水平,并降低RD和A204细胞中细胞周期蛋白CDK4和CDK6表达量。该研究表明,microRNA-133b是通过下调LASP1、c-MET和p-MET的表达水平,影响c-MET下游信号分子p-AKT、p-ERK1/2的表达水平,同时还下调细胞周期相关蛋白如CDK4、CDK6、p-Rb等的表达,从而影响RD和A204细胞的增殖与迁移。     

大黄酸调节Ras/ERK信号通路对肝细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

摘要 目的：探讨大黄酸调节大鼠肉瘤蛋白（Ras）/胞外信号调控激酶（ERK）信号通路对肝细胞癌（HCC）细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法：使用不同浓度（0、12.50、25、50、100、150、200 mol/L）大黄酸处理HepG2细胞,检测细胞活性,筛选最佳大黄酸浓度。将细胞分为对照组、大黄酸低、中、高浓度组、大黄酸高浓度+Ras/ERK激活剂组（大黄酸高浓度+ML-099组）,分别检测各组细胞集落形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数和Ras、p-ERK、ERK蛋白表达。结果：大黄酸以浓度和时间依赖性降低HepG2细胞活性（P<0.05）,选用25、50、100 mol/L处理HepG2细胞24 h用于后续实验;与对照组比较,大黄酸低、中、高浓度组细胞集落形成数、G0/G1细胞比例、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数和原癌基因（c-Myc）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、Ras、p-ERK/ERK蛋白表达呈浓度依赖性降低,S期和G2/M细胞比例、p53蛋白表达呈浓度依赖性增加（P<0.05）;与大黄酸高浓度组比较,大黄酸高浓度+ML-099组细胞集落形成数、G0/G1细胞比例、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数和c-Myc、CyclinD1、Ras、p-ERK/ERK蛋白表达显著增加,S期和G2/M细胞比例、p53蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论：大黄酸可能通过抑制Ras/ERK信号通路抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭。     

干扰素α1b对黑色素瘤细胞A375增殖、迁移和凋亡的影响

目的:研究干扰素α1b(IFN-α1b)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖、迁移和凋亡的影响。方法:采用体外培养的黑色素瘤细胞A375,通过MTT法检测和比较IFN-α1b和IFN-α2b对A375细胞的增殖的抑制作用;细胞划痕实验分析IFN-α1b对A375细胞迁移的影响;Annexin V-FITC/PI染色后采用荧光显微镜观察和流式细胞术分析IFN-α1b对A375细胞凋亡的影响。结果:MTT结果显示随着IFN-α1b和IFN-α2b浓度的增加,A375细胞的生长抑制率逐渐升高,药物作用48 h和72 h后,IFN-α1b作用的A375细胞生长抑制率明显高于IFN-α2b,IFN-α1b和IFN-α2b作用48 h的IC50分别为(22.69±1.52)μg/mL和(35.69±1.01)μg/mL(P0.01);IFN-α1b和IFN-α2b作用72 h的IC50分别为(10.00±0.98)μg/mL和(25.02±0.44)μg/mL(P0.01)。细胞划痕实验显示IFN-α1b能够使A375细胞的迁移指数和迁移能力降低,且随着IFN-α1b药物浓度的增加抑制细胞迁移作用增强。随着50μg/mL IFN-α1b作用的A375细胞的凋亡率为(29.31±0.45)%,较对照组(8.21±1.36)%相比明显上升(P0.01)。结论:IFN-α1b对人恶性黑色素瘤细胞A375具有生长抑制作用,与IFN-α2b相比,IFN-α1b的抑制作用更加显著;IFN-α1b能够降低细胞A375的迁移能力并诱导其凋亡。     

OIP5对肝癌细胞SMMC-7721增殖和侵袭迁移能力的影响

目的:探讨OIP5对肝癌细胞SMMC-7721增殖和侵袭迁移能力的影响。方法:采用RNA干扰技术沉默肝癌细胞中OIP5的表达后,通过qRT-PCR和Western-blot技术检测OIP5的下调效率,CCK-8和平板克隆法检测肝癌细胞的增殖能力,Transwell法检测肝癌细胞的侵袭和迁移能力。结果:转染OIP5-siRNA后,肝癌细胞SMMC-7721中OIP5 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P0.05);同时,与对照组相比,OIP5-siRNA组肝癌细胞SMMC-7721的CCK-8实验的OD值、平板克隆法测得的克隆球个数、Transwell法测得的迁移细胞数与侵袭细胞数均明显低于对照组(P0.05)。结论:OIP5能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭迁移,可能作为肝癌治疗的潜在靶点。     

组织因子对肝癌细胞侵袭能力的影响

组织因子（Tissue Factor,TF）是机体外源性凝血途径的启动因子,发挥生理性止血的重要作用.近来研究表明,TF除凝血功能外尚与多种恶性肿瘤的血管生成,侵袭转移及预后密切相关.为了探讨TF对人类肝癌细胞的影响,将成功构建带有正义/反义TF cDNA的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-TF(+)/(-)转染人肝癌细胞系HepG2,经药物筛选后获得稳定细胞克隆;应用RT-PCR和Western blot检测内源性TF mRNA及蛋白质表达水平的变化;通过体外侵袭实验进一步分析对细胞侵袭能力所造成的影响.结果显示,转染pcDNA3.1-TF(+)质粒的细胞TF表达水平明显升高,相应的其侵袭能力明显增强,而转染pcDNA3.1-TF(-)质粒的细胞TF表达水平,及体外侵袭能力显著下降.研究结果表明,TF可以增强人类肝癌细胞体外侵袭和转移能力,与肝癌的进展相关,可作为原发性肝癌治疗的一个新靶点进行研究.     

Smad7对肝癌细胞增殖和迁移的影响及其临床意义

目的:探究Smad7对肝癌细胞增殖和迁移的影响及其临床意义。方法:通过转染pcDNA3.1(+)-Smad7质粒或Smad7的小干扰RNA使得Smad7在肝癌细胞系HepG2和Huh7中过表达或敲减,应用MTT法检测Smad7对肝癌细胞增殖的影响,采用细胞划痕实验以及Transwell实验探讨Smad7对肝癌细胞迁移的影响。采用qRT-PCR检测9例肝癌癌患者手术切除的组织样本中Smad7的表达。结果:过表达Smad7的肝癌细胞增殖能力与对照组相比有明显的下降,而敲减smad7能够促进肝癌细胞的增殖。过表达smad7的肝癌细胞穿过Transwell小室底膜的能力显著下降,而敲减Smad7能够促进这种能力。Smad7在肝癌癌旁组织中的表达显著高于癌组织。结论:Smad7能够在肝细胞肝癌的进展中发挥负向调控作用。     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及E-cadherin，COX-2表达的影响

目的:探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及钙粘附蛋白E(E-cadherin)、环氧化酶-2(COX-2)表达的影响。方法:体外培养肝癌细胞系(SMMC-7721、MHCC97H)、正常非肿瘤肝细胞系(HL-7702),Transwell小室用于测定细胞的迁移侵袭能力,Western blot蛋白印迹法用于测定Notch1、E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平,并采用DAPT阻断Notch信号通路,比较肝癌细胞系与正常非肿瘤肝细胞系的迁移侵袭能力及肝癌细胞中E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平的改变。结果:SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞的迁移能力强于HL-7702细胞,差异有统计学意义(P0.05);相比于HL-7702细胞,MHCC97H细胞、SMMC-7721细胞中的Notch1、COX-2表达水平均显著升高,E-cadherin的表达水平明显降低(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞发生迁移的能力均弱于对照组,差异有统计意义(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞内COX-2、Notch1的表达量明显降低,而E-cadherin的表达水平升高(P0.05)。结论:Notch信号通路参与肝癌细胞迁移过程,其机制可能与E-cadherin、COX-2的表达相关。     

血清B7-H4水平对肝细胞癌的诊断及预后价值

目的:探讨肝细胞癌(HCC)患者血清B7-H4水平及其临床意义。方法:采用ELISA方法检测和比较116例HCC患者和60例健康对照人群的血清B7-H4水平,并分析血清B7-H4水平和HCC患者临床参数和生存情况的关系。结果:(1)HCC患者的血清B7-H4水平显著高于健康对照组(P0.001);(2)血清B7-H4水平与HCC患者血清AFP水平(r=0.653,P=0.012)和TNM分期(r=0.713,P=0.003)相关;(3)高血清B7-H4组HCC患者5年总体生存率较低血清B7-H4组显著降低(P=0.028);(4)血清B7-H4水平是HCC预后的独立预测因子(P=0.034)。结论:HCC患者的血清B7-H4水平显著上调,对于HCC的诊断及预后判断具有重要的参考意义。     

RNA干扰技术体外抑制肝星状细胞表皮形态发生素表达及其对肝癌细胞迁移能力的影响

肿瘤微环境中肝星状细胞能够影响肝癌细胞的生物学行为.在肝脏发育过程中,肝星状细胞通过表皮形态发生素(epimorphin,EPM,syntaxin2)与肝干细胞接触而促进肝干细胞的功能性分化.EPM在溃疡性结肠炎、间质性肺炎以及结肠癌中也发挥了重要的作用.发现肝细胞癌(HCC)细胞能够促使星状细胞EPM表达上调.为了研究肝星状细胞的EPM对于肝癌可能的作用,构建了针对EPM基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染肝星状细胞,获得了两株携带该干扰片段的细胞系.RT-PCR与Westernblot检测结果表明,转基因干扰星状细胞系EPMmRNA和蛋白质表达量明显降低.之后,使用转基因细胞系的条件培养基对于肿瘤细胞进行侵袭能力的检测,并对星状细胞与肝癌细胞三维共培养,证明EPM干涉后肝星状细胞促进肿瘤细胞迁移的能力降低.结果表明通过RNAi可稳定干扰人肝星状细胞EPM基因的表达,并且EPM能够促进肝癌细胞的转移.     

siRNA沉默KLF4表达促进HeLa细胞迁移与增殖

目的:研究Krüppel样因子4(KLF4)的表达下调对HeLa细胞迁移与增殖的影响。方法:设计合成针对KLF4的si RNA和阴性对照si RNA,并转染至HeLa细胞中。使用含有10 ng/m L TGF-β1和10%胎牛血清的DMEM培养液诱导HeLa细胞发生上皮间质转化,对照组使用不含TGF-β1的培养液。通过Transwell迁移实验和划痕实验观察HeLa细胞迁移变化;通过细胞增殖实验和流式细胞术观察HeLa细胞增殖状况和细胞周期分布。结果:转染了si RNA的HeLa细胞经TGF-β1诱导后,其细胞迁移能力较其他各组显著提高;与转染了阴性对照si RNA和空白对照的细胞相比,转染si RNA的HeLa细胞增殖能力明显提高;TGF-β1可以使HeLa细胞周期发生G1期阻滞,但是采用si RNA干扰KLF4的表达对此过程无明显影响。结论:使用si RNA下调KLF4的表达可以促进HeLa细胞的迁移与增殖。     

KMT6在肝癌细胞转移中的作用及对肝癌预后的影响

目的:探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶6(histone lysine methyltransferase 6,KMT6)对人肝癌细胞转移的调控作用及对肝癌患者预后的影响。方法:采用RNA干涉技术合成靶向KMT6的小干扰RNA(KMT6 siRNA)片段,瞬时转染至人肝癌细胞系Huh-7。随后,分别采用细胞黏附实验、细胞侵袭实验以及划痕迁移实验检测肝癌细胞的黏附、侵袭和迁移等肿瘤细胞转移能力。运用Oncomine数据库和cBioportal肝癌数据库分析KMT6的表达情况及对肝癌预后的影响。结果:靶向KMT6的小干扰RNA(KMT6 siRNA)片段瞬时转染至人肝癌细胞系Huh-7后,KMT6蛋白的表达显著下降,且黏附率、侵袭率和划痕修复率均显著降低(P<0.05)。Oncomine肝癌数据库分析表明肝癌组织KMT6的表达增加,cBioportal肝癌数据库分析表明KMT6基因改变与肝癌患者预后不良密切相关。结论:KMT6分子可促进肝癌细胞黏附、侵袭和迁移,其基因改变与肝癌患者预后不良显著相关。KMT6分子有望成为肝癌治疗的新靶点。     

肝细胞癌患者血清外泌体microRNA表达鉴定

目的:探讨肝癌细胞外泌体中差异表达的microRNAs(miRNAs)在肝细胞癌(HCC)诊断中的应用价值。方法:通过高通量测序筛选肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNAs。实时定量PCR验证差异表达分子;检测差异表达的miRNAs在健康人(Health)、慢性乙型肝炎患者(CHB)、肝硬化患者(LC)及乙型肝炎病毒阳性的肝细胞癌患者(HCC)血清外泌体中的表达。结果:高通量测序筛选到肝癌细胞外泌体中差异表达的miRNA共88种,其中58种表达上调,30种表达下调。选择其中8种差异表达的miRNAs进行q RT-PCR验证,结果显示,此8种miRNAs在细胞上清外泌体、细胞内、癌与癌旁组织中的表达趋势与测序结果一致。miR-221-3p和miR-224-5p在HCC组外泌体中的表达水平显著高于Health组、CHB组和LC组(P0.01),miR-124-3p和let-7a-5p在HCC组外泌体中的表达水平显著低于其他各组(P0.05)。四个组中,miR-21-5p、miR-191-5p、miR-34a-5p和miR-122-5p的表达水平不存在显著性差异(P0.05)。结论:血清外泌体中的miR-221-3p、miR-224-5p、miR-124-3p和let-7a-5p可能成为肝细胞癌的候选标志物。     

线粒体分裂蛋白FIS1通过诱导上皮间质转化促进肝癌侵袭与迁移

目的:研究线粒体分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1,FIS1)介导的线粒体分裂对肝癌细胞侵袭与迁移的调控作用与机制。方法:采用免疫组化实验比较10对肝癌原发灶与转移灶组织中FIS1表达,以明确FIS1与肝癌转移的关系。通过si RNA干扰FIS1的表达后,用Transwell实验检测肝癌细胞迁移与侵袭能力的变化,q PCR与Western Blot检测上皮间质转化标志分子上皮型钙黏蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)、紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、神经型钙黏蛋白(neural cadherin,N-cadherin)、波形蛋白Vimentin的表达。结果:肝癌转移灶组织中FIS1的表达显著高于原发灶组织。干扰FIS1表达后,肝癌细胞迁移和侵袭能力均明显下降,细胞上皮间质转化标志蛋白E-cadherin和ZO-1的表达上调,而N-cadherin和Vimentin的表达下调。结论:线粒体分裂蛋白FIS1在肝癌转移灶组织中高表达,并可能通过调节细胞上皮间质转化促进肝癌细胞转移。     

微小RNA(microRNA)在肝细胞肝癌发生发展中的作用研究进展

MicroRNA是近几年发现的一种非编码小分子RNA,其主要功能体现在参与调节生物个体发育、细胞增殖与分化、肿瘤细胞的发生等多种病理过程中。MicroRNA在调控癌基因和抑癌基因的表达过程中,以及在肝细胞肝癌发生和发展中发挥着关键性的作用。本综述对microRNA在肝细胞肝癌发生发展中的作用进行汇总,以期为肝细胞肝癌的临床诊断以及治疗提供理论参考。     

Klf4的功能研究进展

Klf4作为真核生物转录因子,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程,是体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）的重要诱导因子之一。本文综述了Klf4在细胞增殖、分化、肿瘤发生、皮肤屏障、热休克及iPS细胞诱导等方面的研究进展,为深入研究Klf4在重编程中的作用机制和功能提供参考。     

白藜芦醇对缺氧诱导的肝癌细胞株BEL-7402增殖及凋亡的影响

目的:探讨不同浓度白藜芦醇在常氧环境及缺氧环境下对肝癌细胞株BEL-7402增殖及凋亡的影响。方法:采用MTT法分析不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μmol/L)白藜芦醇在常氧环境及缺氧环境下对肝癌细胞株BEL-7402增殖的影响,应用流式细胞仪检测其对BEL-7402细胞凋亡的影响。结果:不同浓度的白藜芦醇在常氧及缺氧环境中对肝癌细胞株BEL-7402均有明显抑制增殖及诱导凋亡作用,呈剂量-效应相关,其中50、100、200μmol/L白藜芦醇两种环境中对肝癌细胞的抑制率及凋亡率与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。50、100、200μmol/L白藜芦醇,常氧环境中对肝癌细胞的抑制率分别为18.70±2.15%、22.13±2.18%、31.47±2.26%,凋亡率分别为11.82±2.28%、19.80±2.64%、38.00±2.57%;缺氧环境中对肝癌细胞的抑制率分别为17.87±1.76%、23.52±2.29%、29.87±1.51%,凋亡率分别为12.36±3.15%、19.71±2.78%、37.87±4.83%。结论:白藜芦醇在缺氧环境下能抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖并诱导其凋亡,且其作用与常氧环境相似。     

MFN1在肝癌转移中的调控作用研究

目的:探讨线粒体融合蛋白MFN1(mito-fusion 1)在肝癌转移中的作用及其机制。方法:1).采用免疫组化实验检测15对肝癌转移灶组织与原发灶组织中MFN1的表达,以明确肝癌转移时是否伴有MFN1表达的改变。2).采用si RNA (small interference RNA)下调肝癌细胞中MFN1的表达后,提高Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测其迁移和侵袭能力,通过实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot实验分别检测基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1,MMP1)、MMP2、MMP7及MMP9的m RNA和蛋白表达。结果:1)肝癌转移灶组织中MFN1表达显著低于原发灶组织(P0.05)。2).下调MFN1表达后,肝癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高,MMP7的表达显著增加,而MMP1、MMP2与MMP9的表达无明显变化。结论:线粒体融合蛋白MFN1在肝癌转移组织中表达显著降低,可能通过激活MMP7表达,促进肝癌细胞侵袭和转移。