人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0. 018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。     

人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED_(50))为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。     

利用翻译延伸因子1-α启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒16L1蛋白

目的利用翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子(PTEF1-α)基因,通过基因重组替换商业化表达质粒pPink-HC和pPink-LC的启动子PAOX1;在PTEF1-α下游分别克隆绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和HPV 16 L1基因,构建重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1;将重组质粒电转化感受态毕赤酵母PichiaPink strain 1,培养不同时间后,荧光显微镜下观察GFP的表达;分别在YPD、YPG、YPM、YPSor培养基中培养pTEF-16 L1转化菌,检测菌体在不同培养基中的增殖情况;Western blot检测HPV 16 L1蛋白的表达水平。结果重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1经双酶切鉴定和序列分析表明构建正确;荧光显微镜检测显示,在不同培养时间PTEF1-α指导了GFP的成功表达,且表达量随培养时间的延长而降低;重组毕赤酵母在YPD和YPG培养基中生长迅速;4种培养基中均有HPV 16 L1蛋白的特异性表达,且在YPG和YPSor培养基中获得了HPV 16 L1蛋白较持续的表达。结论成功实现了组成型启动子PTEF1-α控制的HPV16 L1蛋白的表达,为HPV疫苗的低成本及方便生产提供了一个可供选择的有效方案。     

GⅡ.21型诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达、纯化及鉴定

目的构建含有GⅡ.21型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1基因的重组质粒,通过PichiaPink毕赤酵母表达VP1蛋白,并鉴定纯化产物。方法合成NoV GⅡ.21 VP1蛋白基因序列,将其连接至pPink-HC载体,构建重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1;经测序鉴定后,电转化毕赤酵母PichiaPink,甲醇诱导目的蛋白表达;采用AKTA pure M150型纯化仪纯化目的蛋白,Western blot法分析其抗原性,SEC-HPLC法检测纯化蛋白出峰时间。结果经测序鉴定,重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1构建正确;纯化的目的蛋白VP1纯度在95%以上,能与抗NoV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗体发生反应;测定目的蛋白出峰时间为16. 923 min,与NoV VLP理论出峰时间一致。结论成功在毕赤酵母高表达了GⅡ.21衣壳蛋白VP1,并制备了高纯度及良好抗原性的目的蛋白,为多价重组NoV疫苗的研发及规模化生产奠定了基础。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

重组人乳头瘤病毒33型L1病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

目的利用毕赤酵母表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)33型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),评价其在小鼠体内的免疫原性。方法构建HPV33 L1表达质粒,电转化毕赤酵母,筛选高表达菌株,15 L发酵罐发酵,离子交换和凝胶体积排阻层析分离纯化HPV33 L1 VLPs,纯化后样品免疫小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠免疫后血清中和抗体滴度。结果质粒HPV33 L1-pPIC3. 5K经双酶切及测序鉴定证明构建成功;毕赤酵母表达产物经Western blot分析,可见相对分子质量约56 000的目的条带;透射电镜下可见直径约60 nm的病毒样颗粒;纯化后的HPV33 L1 VLPs纯度可达95%以上;0. 4和0. 04μg HPV33 L1 VLPs免疫后小鼠血清中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为3 200和566,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论利用毕赤酵母成功表达了HPV33 L1 VLPs,并具有良好的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达

目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。     

人乳头瘤病毒31和33型L1蛋白类病毒颗粒的制备及其免疫原性

目的采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后检测其免疫原性。方法将表达HPV31和HPV33 L1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压均质破碎后,采用亲和层析法纯化HPV31和HPV33 L1 VLPs,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白,透射电镜观察VLPs形态,动态光散射仪分析VLPs粒径大小及分布情况。将BALB/c小鼠随机分为3组:HPV31 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)、HPV33 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)和佐剂对照组(铝含量0.24 mg),分别于0、1、3周经腹腔注射免疫小鼠,于每次免疫后1周经眼球采血,分离血清,采用假病毒中和试验检测血清中和抗体滴度。结果纯化的HPV31和HPV33 L1重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与HPV L1通用型单克隆抗体发生特异性结合。经透射电镜及动态光散射观察,可见VLPs形成,但部分L1蛋白以五聚体的壳粒形式存在,未包装成颗粒。HPV31和33 L1 VLPs初次免疫后1周,即能诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的血清中和抗体,且明显高于佐剂对照组(P0.05),随着免疫次数的增加,HPV31 L1 VLP组和HPV33 L1 VLP组免疫小鼠血清中和抗体滴度也相应增加。结论应用汉逊酵母可高效表达HPV31和HPV33 L1重组蛋白,并形成VLPs。用含铝佐剂的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,具有较好的免疫原性,可作为多价重组HPV疫苗的组分抗原。     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

几种乙炔加压设备性能的比较

阐述并比较了几种加压设备在乙炔加压清净过程中的性能和特点。     

A study of miscibility of blends of polybutadienes of varying microstructure

The miscibility of various amorphous polybutadienes with mixed microstructures of 1,4 addition units (cis, 1,4 and trans 1,4) and 1,2 addition units have been investigated. The studies here involved optical transparency, differential scanning calorimetry, and small angle light scattering. It was found that a 90 percent (cis) 1, 4 addition polybutadiene was immiscible with high (91 percent) 1,2 addition polybutadiene. Reduction of the 1,2 content to 71 percent induced an upper critical solution temperature (UCST) with the cis 1,4 polymer. Polybutadienes with 50 percent and 10 percent 1,2 contents were miscible above the crystalline melting temperature of the cis 1,4 polybutadiene. Immiscibility of the 91 percent 1,2 addition polymer was also found with a 10 percent 1,2 polybutadiene. The latter polymer also exhibits an UCST with the 71 percent 1,2 polymer. The results are used to interpret the characteristics of blends of polybutadienes of varying microstructure.     

粉煤灰中烧失量检测的不确定度分析

以F类粉煤灰为例,详细介绍了测定粉煤灰中烧失量的步骤、计算数学模型、影响测量不确定度的因素以及各项测量不确定度分量评定,人员、设备、材料、方法、环境都是影响测量不确定的因素。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。