真菌细胞色素P450nor与反硝化作用

阐述了真菌细胞色素P450nor的种类,结构和功能以及反硝化作用的机制,并介绍了真菌反硝化作用研究概况,细胞色P450nor的催化机制及 基因表达调控的研究进展。     

小菜蛾细胞色素P450基因的克隆及生物信息学分析

利用RT—PCR技术,从小菜蛾体内克隆了细胞色素P450基因CYP6序列,GenBank登录号为AY971374。生物信息学技术分析表明,该序列由1661bp组成,熔点102℃,退火温度87℃,单链分子质量539．83kDa,双链分子质量1079．65kDa,可以翻译514个氨基酸,组成的蛋白质分子式C2682H4154N702O747S30,分子量是59146．5,总原子数8315,等电点pl为8．63,高级结构与Cytochrome P450 Bm-3基因有较高的相似性。     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P—450nor的分离纯化

用ＤＥ－５２纤维素柱色谱法和ＦＰＬＣ法分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌色素Ｐ－４５０ｎｏｒ，经梯度洗脱ＭｏｎｏＱ纯化后的ｆＲ．Ｐ－４５０ｎｏｒ为单一色谱峰，比活达５５．２０Ｕ／ｍｇ、纯化倍数约为１１００倍，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测为单一谱带。     

冬虫夏草菌NADPH-细胞色素P450还原酶基因的生物信息学分析

细胞色素P450家族和真菌致病性有关,而细胞色素P450的催化活性又依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶(CPR)提供的电子.为进一步探讨NADPH-CPR基因多样性对冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis侵染寄主的影响,扩增获得2个冬虫夏草菌NADPH-CPR基因,利...     

真菌一氧化氮还原酶细胞色素P—450nor 2 cDNA序列的测定

真菌一氧化氮还原酶细胞色素Ｐ４５０ｎｏｒ２ｃＤＮＡ序列的测定刘德立（华中师范大学生命科学学院武汉４３００７０）ＨｉｒｏｆｕｍｉＳＨＯＵＮ（筑波大学应用生物化学系日本）在真菌的反硝化作用中,一种细胞色素Ｐ４５０起着一氧化氮还原酶的作用,被称为细胞色...     

柱孢菌细胞色素P－450nor2cDNA克隆与表达

在真菌的反硝化作用中,一种独特的细胞色素Ｐ－４５０起着一氧化氮还原酶（Ｐ－４５０ｎｏｒ）的作用。用ｇｔｌｌ构建了柱孢菌（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｔｏｎｌｅｉｎｅｎｓｅ）ｃＤＮＡ文库。纯化的柱孢菌Ｃ。Ｐ－４５０ｎｏｒ２免疫兔,制备抗体。并用抗体筛选出阳性克隆。回收插入片段（Ｐ－４５０ｎｏｒ２ｃＤＮＡ）克隆到表达载体ｐＹＥＳ２中,并在酵母系统中表达。经Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ分析验证,表达产物能与抗体反应产生特异性杂交带。酶分析结果表明：表达产物具有一氧化氮还原酶细胞包素Ｐ－４５０ｎｏｒ２的活性,能以ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ为供体,使ＮＯ还原先成Ｎ２Ｏ。     

柱孢菌细胞色素P—450nor2cDNA克隆与表达

在真菌反硝化作用中,一种独特的细胞色素Ｐ－４５０起着一氧化氮还原酶的作用。用λｇｔｌｌ构建了柱孢菌ｃＤＮＡ文库。纯化的柱孢菌Ｃ．Ｐ－４５０ｎｏｒ２免疫兔,制备抗体。并用４抗体选出阳性克隆。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

昆虫细胞色素P450研究:P450基因

细胞色素P450广泛存在于生物界,它因参与许多外来物质和内源性物质的代谢而具有十分重要的作用［1－5］细胞色素P450的研究大约有50多年的历史[3]。60年代的工作主要是对这一血红素蛋白的生物化学和生物物理学特征的了解以及膜结合P450酶系的酶学功能[3]。70年代的研究集中在细胞色素P450酶系的分离纯化及其活性的重组。纯化P450的成功证明了许多P450在物理学和酶学特征方面的不同,也为制备抗体及利用抗体来确定某种P450的存在与数量以及抑制特定P450的酶活性提供了手段,使进一步阐明P450的反应机制成为可能。80年代分子生物学技术的…     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P-450nor的分离纯化

用DE－52纤维素柱色谱法和FPLC法（fastProteinliquidchromatography）分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌细胞色素P－450nor（recombinant　fusariumoxvsporumcytochromeP－450nor,rF．P－450nor）．经梯度洗脱MonoQ纯化后的rF．P－450nor为单一色谱峰,比活达55．20U／mg,纯化倍数约为1100倍,SDSPAGE检测为单一谱带．     

家蚕细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450参与许多基础代谢过程, 确保有机体避免外源复合物对它们的伤害. 将预测的家蚕基因同已知的P450基因进行蛋白质序列比对, 在家蚕基因组中发现86个可能的细胞色素P450基因, 初步将它们归于32个P450亚家族. 通过比较基因组学分析, 发现细胞色素P450基因在果蝇与家蚕中的分布规律具有总体上的相似性, 但在某些P450基因家族中的分布也有差异. 特别是在CYP4A, CYP4C, CYP4D, CYP6A, CYP6AE, CYP6B和CYP9A等7个亚家族中P450s差异分布更明显. 进一步将这些P450基因的DNA序列与家蚕ESTs进行核酸序列比对, 其中49个可能P450基因发现有ESTs证据, 证明了这些基因在转录水平的真实性.     

烟草细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450是一类含血红素的单加氧酶超基因家族, 在植物多种代谢途径中起着重要作用。为了解烟草中的P450的种类和数量, 文章将植物代表性P450蛋白质序列与烟草基因组序列比对, 在烟草基因组中鉴定了44个P450家族共263个成员。将这些烟草P450基因与烟草表达序列标签(EST)比对, 发现173个成员有EST证据。通过与拟南芥中已知的P450蛋白序列比较, 分析了部分烟草P450蛋白序列的特征和二级结构。根据烟草基因芯片数据和部分基因的RT-PCR结果, 发现73个烟草P450基因能够在不同的生长发育时期表达, 其中部分基因具有组织特异性。这些研究结果为烟草P450基因功能的深入分析奠定了基础。     

水溞基因组P450基因家族的分析

利用水溞基因组mRNA和氨基酸数据库对P450基因进行搜索和分析．结果显示：在水溞基因组中发现71个P450基因,它们分别属于15个P450家族和17个亚家族．是一个典型的多基因家族。以氨基酸相似度大于60％为标准对水溞P450基因进行分组．则71个P450基因中．16个为孤儿基因,不能被归入任何一组：其余55个可归入12个组,其中8个组,包含47条序列适合于正选择和基因转换分析。结果表明：有3个组,含22个基因显著受到正选择压力作用．其中的2个组．含18个基因有正选择概率大于95％的氨基酸位点228E或277T．228E和277T分别位于底物识别位点SRS2和SRS5;有5个组,包含19个基因显示显著的基因转换事件;既显著受到正选择压力作用,又参与基因转换的基因共12个：相反．检测出既没有受到显著的正选择压力作用．又没有基因转换的基因18个。可见．发生基因转换的基因与受到显著正选择的基因有高度的相关性：发生过基因转换的基因中63．2％都受到显著的正选择压力作用,同时,受正选择压力作用的基因中有54．5％发生了基因转换。此外．鉴定出20个不同的基序．其中有5条基序在90％以上的基因中出现。     

昆虫细胞色素P450的研究:P450基因的进化

80年代分子生物学方法被用于分离和鉴定特定P450的CDNA或基因组克隆［‘］,至今已知的P450基因包括70个基因家族、127个亚家族的40O多个,基因序列的数量还在迅速增加I’］。不同P450间的进化关系在一些综述中都有涉及［”’,‘］,本文介绍这一主题的一些主要观点,重点放在P450功能的进化及其机制。亚细胞色素P450的基本特征及其分类与命名所有细胞色素P450具有一非共价结合的血红素和环绕高度保守的半跳氨酸的一段26氨基残基的保守序列,这一半跳氨酸提供血红素铁的第5个配体（ligand）。当血红素铁接受电子被还原后再与CO结合产…     

毛竹细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450单加氧酶(P450s)是一类在450 nm处有特征吸收峰的血红素硫蛋白基因超家族,在许多物质代谢中至关重要,还与解毒代谢密切相关。在毛竹基因组中鉴定出41个P450家族,共197个成员,涉及10个基因簇(clan)。通过基因结构与进化树的比较,进一步了解结构与进化之间的联系。通过与水稻和拟南芥一起构建的进化树,分析了毛竹P450基因家族的差异性。二级结构分析表明,毛竹P450蛋白序列同样具备有P450蛋白特征性结构域。在毛竹中,共有104个P450基因能够在不同生长发育时期有不同程度的表达。     

重组缣孢菌细胞色素P-450nor的性质研究

纯化的重组缣孢菌细胞色素P-450nor（recombinant fusarium oxysporum cytochrome P-450nor,rF·P-450nor）用于动力学研究. 测得米氏常数K_m(NO)和K_m(NADH)分别为0.128 mmol/L和0.208 mmol/L. V_max(N₂O)为11 363 min^-1. 光谱吸收特性研究表明：rF·P-450nor具有典型的血红素蛋白的特性,在413 nm有最大吸收峰. 加入还原剂Na₂S₂O₄时,最大吸收峰前移至405 nm. 与CO结合后,再加入还原剂Na₂S₂O₄时,在450 nm处表现最大吸收.与NO结合后,最大吸收峰移至430 nm附近. 这些光谱特征的变化与天然的F·P-450nor完全一致.     

豌豆蚜基因组P450基因家族的分析

细胞色素P450在各种内源和外源物质代谢中起着非常重要的作用。利用豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因组mRNA和氨基酸数据库研究P450基因功能的进化规律。通过生物信息学方法对豌豆蚜全基因组P450进行分析, 结果显示: 在豌豆蚜基因组中发现69个P450基因, 它们分别属于13个P450家族和18个亚家族, 是一个典型的多基因家族。进一步将这些基因与豌豆蚜ESTs数据库进行了比对分析, 其中39个候选基因有EST证据, 证明了这些P450基因在转录水平的真实性。以氨基酸相似度大于60%为标准对豌豆蚜基因组中P450基因进行分组, 69个P450基因中, 除18个基因序列因差异太大, 不能被归入任何一组, 其余51个可归入10个组, 其中8个组(包含47条序列)适合于正选择和基因转换分析。正选择和基因转换分析结果表明: 仅有1个组(含9个基因)显著受到正选择压力作用, 正选择概率大于95%的氨基酸位点分别是20T和27N, 20T位于底物识别位点SRS1, 27N位于D. helix; 有3个组(包含8个基因）显示显著的基因转换事件。 参与基因转换的基因均为CYP4家族成员, 分别是CYP4C, CYP4G和CYP4V亚家族。 参与基因转换的成员之间的蛋白相似度较高（70％~95％）, 且XM_001944991与XM_001951794同存在于SCAFFOLD12542上, XM_001945510与XM_001944057同存在于SCAFFOLD7010上。这可能暗示豌豆蚜P450基因通过基因复制, 然后通过基因转换使P450获得新的功能, 以适应多变的生存环境。此外, 鉴定出20个不同的基序, 其中有5条基序在90％以上的基因中出现。      

Involvement of a Glu71–Arg64 Couple in the Access Channel for NADH in Cytochrome P450nor

Putative access channel for NADH in the heme-distal pocket of cytochrome P450nor (P450nor) comprises many charged amino acid residues. Characterization of the E71A mutant protein of P450nor highlights the existence of a unique mechanism for binding NADH that depends on the salt bridge network between Glu71, Arg64 and Asp88.