融合蛋白D2C-SN对登革2型病毒增殖的影响

目的：观察登革2型病毒衣壳蛋白（D2C）与葡萄球菌核酸酶（SN）融合蛋白在哺乳动物细胞中对登革2型病毒增殖的影响。方法：通过基因重组构建可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白D2C-SN的重组质粒pc／D2C-SN，同步构建pc／D2C-SN用作对照。病毒感染BHK21细胞后，通过阳离子转染试剂将重组质粒导入感染细胞，在此基础上评价融合蛋白D2C-SN抗登革病毒感染的治疗效果。结果：融合蛋白D2C-SN能够在哺乳动物细胞中表达，对宿主细胞没有明显的毒性；与正常BHK21细胞相比较，可导致病毒感染性滴度降到原来的1／60—1／12。结论：融合蛋白D2C-SN在细胞水平能够有效抑制登革病毒的增殖。有可能成为潜在的抗登革病毒感染的治疗性药物。     

登革2型病毒NS5蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的 :构建登革 2型病毒 (DEN_2 )NS5表达体系 ,摸索适宜的诱导表达条件 ,克服大分子蛋白难以表达的瓶颈 ,获得DEN2_2NS5 (相对分子质量 10 4× 10 3)表达产物 ,为以后对其活性、抑制剂等方面的研究奠定基础。方法 :自DEN_2感染组织提取总RNA ,RT_PCR扩增NS5基因片段 (2 .7kb) ,插入质粒pQE30 ,转化XL1Blue大肠杆菌得表达菌株XL1Blue QENS5。同时优化诱导表达和目的蛋白的纯化条件。结果 :表达菌株XL1Blue QENS5增菌培养后更换新的培养基 ,在一定温度范围条件下诱导可以表达出最高占菌体总蛋白 2 2 .8%的NS5蛋白 ,在较低温度下诱导目的蛋白能以可溶性形式表达 ,经过纯化后的NS5蛋白纯度可达 90 %以上。结论 :在国内首次实现了DEN_2NS5蛋白的表达 ,获得的诱导表达条件可能对于其他大分子蛋白的表达有一定的借鉴意义。     

SARS冠状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达

目的构建SARS冠状病毒主要结构蛋白原核表达载体,并探讨各结构蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达情况及其病毒致病机制。方法从SARS病人组织中抽提出RNA,经RT-PCR获得SARS冠状病毒刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,将S基因的两个区段、N基因和M基因分别克隆至表达载体pET-32和pET-28上,转化大肠杆菌13121,利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况。结果成功构建了SARS冠状病毒重组蛋白的表达载体pET32-S1、pET32-S2、pET32-N、pET32-M、pET28-S1、pET28-S2和pET28-N;N蛋白表达量最高,S2蛋白表达量次之,S1蛋白和M蛋白表达不明显。结论SARS病毒的N蛋白较容易在原核细胞中表达,而S蛋白和M蛋白可能由于有较多的半胱氨酸或跨膜区而不易在体外表达。N蛋白和S蛋白均有较好的抗原性。前者更适用于SARS的早期诊断。     

RAP结合肽-hFcγ1融合蛋白的表达与初步活性鉴定

目的：将肽库筛选到的正调控金黄色葡萄球菌(金葡菌)外毒素分泌的关键分子RAP(RNA Ⅲ activating protein)的结合肽与人IgG1抗体Fc片段(hFcγ1)融合表达，检测其干扰金葡茵外分泌毒素产生的活性。方法：根据噬茵体肽库筛选到的RAP结合肽序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子合成基因片段，将其融合在人IgGl抗体Fc片段基因序列的5’端，构建pET-rapbp-fc融合表达载体，转化大肠杆菌并诱导表达。以包涵体形式存在的目的蛋白经变性、复性后。ELISA实验分别证实其与抗人IgG抗体及纯化RAP的结合活性。以MDBK细胞株为模型，MTI实验观察融合蛋白对金葡菌196菌株外分泌毒素水平的影响。结果与结论：融合基因在大肠杆菌中获得表达。复性后，融合蛋白的Fc片段及结合肽部分分别能够与抗人IgG抗体及RAP结合，且能在一定程度上降低金葡菌196株上清中的毒素水平。     

内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

应用PCR技术,从含人NH@LBP cDNA的质粒中扩增出93bp的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段,插入原核融合蛋白表达质粒Pinpoint Xa3的多克隆位点构建成表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子Pinpoint Xa3-EBP并进行酶切鉴定及序列分析.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,经SDS-PAGE及Westen blot鉴定得到分子量约为16.5kD的生物素化EBP融合蛋白,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础,并为内毒素结合肽的研究提供了一条新的途径.     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213,制备高纯度的GCRG213蛋白。方法 采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果 SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约29．4kD的Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白的28．7％。经凝胶回收法得到纯度近1009,5的蛋白产品。结论 在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白,并制备出高纯度蛋白产品,为后续的功能研究及其抗体研制奠定了基础。     

串联MS2衣壳蛋白和MS2特异结合RNA表达载体构建及应用

目的构建体内研究RNA-蛋白相互作用的表达载体。方法利用MS衣壳蛋白可与MS2结合位点（MS2bs）RNA特异性结合的特点,通过设计特异引物,构建pcDNA3．0-Flag．2XMS2和pcDNA3．0—12XMS2％s表达载体,以及表达MEG3非编码RNA的表达载体pcDNA3．0-EG3V1—12XMS2bs。共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证。结果成功构建了pcDNA3．0-Flag-2XMS2和pcDNA3．0．12XMS2bs表达载体,实时定量PCR结果表明,与对照相比能明显富集MEG3V1非编码RNA分子。结论成功构建了体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,为RNA一蛋白相互作用研究提供了新的技术方法。     

重组人瘦素融合蛋白在大肠杆菌中的低温自诱导表达、纯化和活性鉴定

目的:建立低温自诱导表达重组人瘦素(leptin)融合蛋白的系统方法,经体外纯化获得大量具有生物活性的瘦素蛋白.方法:从cDNA文库中扩增瘦素编码区,克隆到pGEM-T easy载体,测序正确后亚克隆到A1.3表达载体,转入BL21(DE3),低温自诱导表达.用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定表达产物.对低温自诱导表达产物rMBP-10His-Leptin进行纯化和酶切,获得可与瘦素单抗发生特异性反应的瘦素蛋白.用Km小鼠减肥实验检验其生物学活性.结果:在22×103处有明显的新增蛋白带,含量超过总蛋白的40%,Western印迹证实为瘦素蛋白.Km小鼠减肥实验证实其具有生物学活性.结论:成功建立了低温诱导表达rMBP-10His-Leptin的系统方法,获得大量瘦素蛋白,经验证表达产物具有免疫活性和生物学活性,可供进一步基础及临床研究应用.     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

登革病毒DNA疫苗的研究进展

目前登革病毒（ dengue virus ）感染已成为全球严重的公共卫生问题,亟待有效的疫苗进行特异性预防。与减毒活疫苗、灭活疫苗等传统疫苗相比,DNA疫苗具有制备简便、价格低廉、无感染风险、便于储运以及长效性好等特点,成为近年来登革病毒疫苗研究的热点。该文综述了登革病毒DNA疫苗构建策略、接种方式、免疫策略、免疫佐剂、免疫效果等方面的研究进展。     

登革病毒NS1蛋白研究进展

登革病毒感染可引起登革热及登革出血热/登革休克综合征,是热带与亚热带地区重要的公共卫生问题。登革病毒非结构蛋白NS1（nonstructural protein1）,在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用。该文综述了近年来登革病毒非结构蛋白NS1结构与功能的研究进展。     

扩增我国登革2型病毒全长cDNA分子的融合PCR方法

目的：建立扩增登革2型病型基因组全长cDNA的融合PCR法，为深入探讨病毒基因的结构与功能提供有效的技术途径，方法：根据我国登革2型病毒D2－43株列设计引物，首先采用长链RT－PCR技术扩增病毒基因组5‘及3‘半分子，然而以阗分子采用融合PCR法将两个半分子建成全长cDNA分子，为进一步证实所构建全长cDNA分子的特异性，再以融合PCR产物为模板扩增5‘非编码区序列，与pGEM-T载体连接，在377A型自动测序仪进行序列分析，结果：通过对逆转录反应及PCR扩增条件的优化，建立了制备大片段cDAN及构建全长cDNA分子的融合PCR方法，扩增的我国登革2型病毒的5‘及3‘半分子的半度均为5kb左右，采用融合PCR方法制备的全长cDNA长约11kb，与预期大小一致，非编码区测序结果表明扩增产物为D2－43所特有，结论：所建立的融合PCR方法是构建登革闰因组全成cDNA的有效技术。     

登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响

目的：分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响。方法：利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平。结果：获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降。结论：登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。