5-杂氮-2′-脱氧胞苷对实验性乳腺癌肺转移的影响

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对乳腺癌MDA-MB-231细胞实验性肺转移的影响及可能的机制。方法将MDA-MB-231细胞分为对照组与5-Aza-CdR处理组,通过半定量RT-PCR(SqRT-PCR)与甲基化特异性PCR(MSP)方法检测两组细胞的乳腺癌转移抑制基因-1(BRMS1),CXC趋化因子受体-4(CXCR4)基因的mRNA表达及启动子区甲基化的状况。分别将两组细胞通过边缘尾静脉注射至BALB/c nu/nu裸鼠体内(每组5只)。5周后,用荧光定量RT-PCR(FqRT-PCR)检测裸鼠肺组织内的目的基因HPRT及内参GAPDH的mRNA丰度。结果对照组和处理组细胞的BRMS1相对灰度值(IDV)分别为0与0.39±0.001,处理组BRMS1 mRNA表达较对照组明显上调(P0.05),5-Aza-CdR使BRMS1启动子区甲基化的CpG岛B完全去甲基化;CXCR4相对IDV分别为0.58±0.003与0.58±0.01,两组间差异无统计学意义(P0.05),CXCR4启动子区CpG岛1的非甲基化状态亦无明显改变。对照组与处理组细胞的裸鼠肺脏HPRT和GAPDH的Ct值分别为:24.75±1.55,16.19±0.69与27.61±1.67,17.48±0.96,2-ΔΔCt=0.34,处理组裸鼠肺脏HPRTmRNA丰度明显低于对照组,肺组织内转移癌较少。结论 5-Aza-CdR通过去甲基化机制重新激活肿瘤转移抑制基因BRMS1的表达,从而降低了MDA-MB-231细胞实验性肺转移能力。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合多西紫杉醇对前列腺癌细胞系PC3恶性表型抑制作用的实验研究

目的:观察甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dc)联合多西紫杉醇(DT)对人前列腺癌(PCa)细胞系PC3细胞增殖、迁移、侵袭能力、细胞周期变化和细胞凋亡的影响,探讨上述两种药物联合应用对前列腺癌细胞的体外抗肿瘤效应。方法:实验分为对照组、5-aza-2dc组、DT组及5-aza-2dc和DT联合用药组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、划痕损伤实验、细胞迁移实验分别观察5-aza-2dc和(或)DT对PC3细胞株增殖、迁移、侵袭能力的抑制效应,利用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其与细胞周期的关系。结果:5-aza-2dc组、DT组及联合用药组均能明显提高对PC3细胞的抑制率,降低细胞迁移距离,减少侵入下室的细胞(P<0.05),联合用药组作用更明显;对照组、5-aza-2dc组、DT组及联合用药组细胞凋亡率分别为(10.65±0.39)%、(16.60±0.67)%、(17.95±1.08)%、(22.98±1.18)%,各用药组均能明显提高细胞凋亡率,联合用药组作用更明显(P<0.05);联合用药组能明显减少G0/G1期细胞,增加G2/M期细胞(P<0.05)。结论:5-aza-2dc和DT单独及联合应用均能在体外细胞水平显著抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭作用,诱导细胞凋亡,使细胞停滞于G2/M期,两药联合的作用比各单药作用大,5-aza-2dc和DT联合作用于PC3细胞具有协同作用,值得进一步研究。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对MDA-MB-231乳腺癌细胞SLIT2基因去甲基化作用及细胞运动能力的影响

目的 观察5-氮杂-2’-脱氧胞苷( 5-Aza-dc)对恶性乳腺癌MDA-MB-231细胞Slit2启动子的去甲基化作用及细胞运动能力的影响.方法 用5、10、20 μmol/L 5-Aza-dc分别处理MDA-MB-231乳腺癌细胞;噻唑蓝(MTT)比色法筛选能够恢复MDA-MB-231细胞Slit2表达的5-Azadc最适浓度为10 μmol/L;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测对照组和10μmol/L处理组Slit2mRNA的表达;划痕实验和趋化实验检测5-Aza-dc给药后,乳腺癌细胞的非定向与定向运动能力的变化;聚集实验检测5 -Aza-dc对MDA-MB-231细胞间黏附能力的影响.结果 在RT-PCR结果中,对照组和10 μmol/L 5-Aza-dc处理组Slit2/GAPDH的密度比值分别为0.630±0.042和1.307±0.057,表明5-Aza-dc可有效恢复乳腺癌MDA-MB-231细胞Slit2的表达(P＜0.05).体外趋化实验显示10 μmol/L 5-Aza-dc处理的MDA-MB-231细胞定向运动能力降低(P＜0.01),趋化凶子上皮生长因子(EGF)浓度为10 μg/L时实验组穿过膜的细胞数为49.46±2.92;对照组为99.44±2.54.伤口愈合实验发现10μmol/L 5-Aza-dc处理的MDA-MB-231细胞非定向运动能力降低(P＜0.05),24h时实验组运动的距离为(0.330±0.016) mm;对照组为(0.440±0.045) mm.聚集实验显示10 μmol/L 5-Aza-dc处理的MDA-MB-231细胞间黏附能力增加(P＜0.01),60 min时实验组聚集指数为0.300±0.028,对照组为0.600±0.034.结论 5-Aza-dc可以使MDA-MB-231乳腺癌细胞Slit2启动子区去甲基化,使Slit2基因表达升高,恢复其抑制肿瘤运动的能力.     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响

目的 检测E-cadherin基因在激素非依赖性前列腺癌(HIPC)细胞上的表达及启动子CpG岛甲基化,探讨甲基化抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对HIPC细胞的影响及意义.方法 2.5、5.0、10.0 μmol/L的5-Aza-CdR处理PC-3细胞72h后,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测CpG岛甲基化改变,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测E-cadherin mRNA变化,Westernblot方法检测E-cadherin蛋白变化,Transwell小室检测细胞侵袭性改变.结果 HIPC的E-cadherin启动子CpG岛甲基化呈阳性,基因表达缺失,细胞侵袭性明显.经5-Aza-CdR作用之后,CpG岛甲基化阳性明显减弱(P＜0.05),E-cadherin基因恢复表达(P＜0.05),PC-3细胞的侵袭性下降约59.68％,且与药物的浓度呈正相关.结论 5-Aza-CdR可逆转PC-3细胞E-cadherin启动子CpG岛的异常甲基化,诱导mRNA转录和蛋白的表达,并降低癌细胞的侵袭性.     

去甲基化剂5-氮杂-2''''-脱氧胞苷对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨去甲基化剂5氮杂2’脱氧胞苷(5AzaCdR)对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:使用浓度5×106mol/L和105mol/L的5AzaCdR处理胃癌细胞株AGS、SGC7901、MKN28及MKN45。通过MTT、平板克隆实验观察处理前、后细胞的生长活性,RTPCR检测处理前、后抑癌基因RASSF1AmRNA表达的改变,并应用流式细胞仪进行细胞周期和凋亡率的分析。结果:4株胃癌细胞经不同浓度之5AzaCdR处理后,与对照组相比,生长速度出现不同程度减慢;实验组AGS细胞较对照组细胞克隆形成率显著降低(32.4%、28.5%比57.0%,P<0.01);5AzaCdR处理后,3株无RASSF1AmRNA表达的细胞(AGS、MKN28和SGC7901)均检出基因重新表达;处理前后4株胃癌细胞无明显G1期、G2/M期改变,AGS细胞凋亡率由0.6%增至18.6%和20.2%,MKN28细胞亦出现凋亡率由1.85%增至3.85%和6.61%。结论:去甲基化剂5AzaCdR对胃癌细胞生长周期无显著影响,可能系通过诱导抑癌基因再表达或凋亡等途径,间接抑制胃癌细胞的生长。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对HepG2中SLIT2甲基化和细胞恶性表型影响的实验研究

目的评估5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2dc）对人肝癌细胞系HepG2中抑癌基因SLIT2甲基化状态和细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,探讨SLIT2基因在肝癌中的作用及5-aza-2dc的体外抑制肝癌的效应。方法实验分为对照组和加药组,分别应用MSP、MTT、划痕实验、侵袭实验、AnnexinV—FITC／PI双染实验检测细胞中SLIT2基因的甲基化状态和细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡的变化。结果5-aza-2dc处理后,HepG2细胞株中SLIT2基因甲基化程度得到一定程度逆转,并呈现出剂量依赖性;划痕实验48h后,对照组肝癌细胞明显向划痕的中央迁移,而药物处理组肝癌细胞迁移受到抑制;侵袭实验24h后,加药组细胞的侵袭能力较对照组降低（P〈0．05）;AnnexinV．FITC／PI双染实验显示加药组细胞凋亡率显著增加（P〈0．01）。结论5-aza-2dc对HepG2细胞有抑制细胞增殖、促进凋亡及抑制细胞迁移和侵袭能力等作用,其中对抑制细胞迁移和侵袭的作用可能是通过逆转SILT2基因甲基化、恢复其表达来实现的。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷诱导肝癌细胞株癌/睾丸抗原基因表达的研究

目的探讨使用5杂氮2′脱氧胞苷(5DC)诱导肝癌细胞株癌/睾丸抗原(cancer/testis,CT)基因的可行性。方法使用5DC处理前后,用RTPCR方法检测肝癌细胞株QGY7703、HepG2215、HepG2、SMMC7721、HLE、BEL7402、Huh7、BEL7404中CT抗原基因MAGEA1、A3、A6和A10表达;Southern杂交检测细胞株基因组DNA去甲基化状态。结果CT抗原家族中MAGEA1在QGY7703、SMMC7721、BEL7402、HLE、BEL7404中表达,MAGEA3在HepG2、HLE中表达,MAGEA4和MAGEA10表达均为阴性,而MAGEA6表达均为阳性;使用5DC后,MAGEA4在QGY7703、HLE中出现表达,MAGEA10在HepG2和HLE出现表达。去甲基化后基因组DNA相对去甲基化程度明显升高(t=-4.966,P<0.01)。结论尽管5DC使肝癌细胞株基因组去甲基化程度明显升高,但不能有效地诱导CT抗原基因广泛表达。     

5-氮-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素诱导脾酪氨酸激酶基因去甲基化及转录和表达

目的 观察去甲基化药物(5-氮-2-脱氧胞苷)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(曲古抑菌素)对结直肠癌细胞HCT-15中脾酪氨酸激酶基因表达、细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 应用2.5 μmol/L的5-氮-2-脱氧胞苷和1 μmol/L的曲古抑菌素分别或联合处理HCT-15细胞,通过甲基化特异性聚合酶联反应、逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹检测处理前后脾酪氨酸激酶的甲基化状态和表达;氚胸腺嘧啶掺入法和体外细胞侵袭试验研究去甲基化前后细胞增殖力和侵袭力的变化.结果 (1)5-氮-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素可使脾酪氨酸激酶基因去甲基化而恢复表达,曲古抑菌素增强5-氮-2-脱氧胞苷的去甲基化作用;(2)与脾酪氨酸激酶失表达阴性对照组比较,5-氮-2-脱氧胞苷、曲古抑菌素和联合用药组及脾酪氨酸激酶稳定表达阳性对照组中细胞增殖力分别下降30%、25%、45%和54%;细胞侵袭力分别下降22%、27%、43%和64%.结论 5-氮-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素可恢复甲基化脾酪氨酸激酶基因的重新表达,抑制细胞增殖,降低细胞侵袭和转移力.     

乳腺癌血行转移与血管生成相关因子相关性研究

目的探讨血管生成相关因子:癌基因HER2、缺氧诱导因子(HIF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在乳腺癌组织中的表达及其与血行转移的相关性。方法应用免疫组织化学技术(SP法)检测51例乳腺浸润性导管癌组织中HER2、HIF-1α、VEGF蛋白的表达并随访其术后5年内远处血行转移的情况。结果51例乳腺浸润性导管癌组织中HER2、HIF-1a和VEGF表达均彼此相关。单因素分析显示44例乳腺浸润性导管癌中HER2、VEGF、淋巴结转移和临床肿瘤分期与癌的远处血行转移相关,HIF-1α表达与远处血行转移不相关(P>0.05)。23例淋巴结阴性乳腺癌中,仅VEGF表达与其远处血行转移密切相关(P<0.05)。结论乳腺浸润性导管癌组织中HER2可能通过HIF-1α途径调节VEGF蛋白的表达,参与乳腺癌血管的生成。VEGF表达可作为术后预测血行转移的指标之一,HER2过度表达和HIF-1α表达不能预测远处血行转移。     

小鼠人乳腺癌自发性肺转移模型的建立

目的　建立小鼠人乳腺癌自发性肺转移模型。方法　将人乳腺癌细胞株MDA MB 43 5s( 2× 10 5/只 )原位接种至 2 0只重症联合免疫缺陷 (SCID)小鼠 ,17周后处死 ,肉眼及显微镜下观察肺转移状况。结果　 17周后存活的 8只小鼠中 4只 ( 5 0 % )肉眼下见肺转移灶 ,1～ 3个肺转移灶/只 ,直径 1～ 2mm ,显微镜下所有 8只小鼠均观察到肺转移。结论　将MDA MB 43 5s细胞原位接种至SCID小鼠可成功建立小鼠人乳腺癌自发性肺转移模型。     

曲古菌素A抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制

目的研究组蛋白去乙酰酶抑制剂—曲古菌素A（TSA）对乳腺癌T47D细胞增殖的影响和机制。方法不同浓度的TSA作用乳腺癌T47D细胞5d,噻唑蓝（MTr）法检测药物作用前后细胞增殖的情况。流式细胞仪检测TSA作用36h后细胞周期的改变。逆转录·聚合酶链反应（RT-PCR）检测TSA作用36h后Maspin mRNA的表达。结果TSA在20μg/L浓度以上可以明显抑制乳腺癌T47D细胞的增殖,并呈现剂量和时间的依赖性。细胞周期检测发现100μg／LTSA可导致细胞G1期阻滞,并诱导细胞凋亡;而500μg／LTSA可显著的诱导细胞凋亡。RT-PCR显示100μg／LTSA作用36h后Maspin mRNA的表达增强,但在20μgL时其表达与对照组差异无统计学意义。结论TSA可以抑制乳腺癌T47D细胞的生长,可能通过诱导细胞凋亡和Maspin基因的重新表达发挥抑癌作用。TSA可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。     

5-Aza-CdR调控胃癌细胞系RASSF1A基因表达及对细胞生长的抑制作用

目的观察去甲基化制剂5-Aza-CdR对体外培养的胃癌细胞SGC7901RASSF1A基因的去甲基化和表达调控及生长抑制作用。方法5-Aza-CdR处理SGC7901细胞后,应用MTT法、流式细胞术、AnnexinV．FITC染色法检测细胞增殖活性、细胞周期分布及细胞凋亡率;应用MSP、RT-PCR及Westem印迹法检测RASSF1A基因的甲基化状态、mRNA及蛋白表达。结果5-Aza-CdR处理后,胃癌细胞SGC7901生长受到抑制（P〈0．05）,细胞周期呈现G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加（P〈0．05）。RASSF1A基因在SGC7901中呈异常甲基化状态,在mRNA及蛋白水平表达阴性：5-Aza-CdR处理后RASSF1A基因呈去甲基化状态,在mRNA及蛋白水平重新表达。结论去甲基化制剂5-Aza-CdR调控胃癌细胞SGC7901RASSF1A基因去甲基化及重新表达．对SGC7901细胞具有生长抑制作用。     

脂氧合酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

目的 探讨脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈创木酸（NDGA）对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法 噻唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线及检测细胞存活率；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞凋亡。结果 MTT法显示NDGA对MCF-7细胞生长增殖有明显的抑制作用（P〈0.05），呈剂量和时间依赖效应；流式细胞仪结果显示NDGA阻滞细胞周期于S期，诱导细胞凋亡；在光镜和扫描电镜下，NDGA诱导细胞发生凋亡形态学变化，导致细胞表面超微结构的改变和凋亡小体的形成。结论 NDGA能够抑制MCF-7细胞的增殖，诱导细胞凋亡，为脂氧合酶抑制剂临床应用于乳腺癌提供了科学依据。     

5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷联合吉西他滨对胰腺癌细胞株原钙黏蛋白8基因表达的影响

目的 研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因DNA启动子甲基化的转录调控,以及联合吉西他滨对癌细胞生长抑制与凋亡的影响.方法 采用MTT法、流式细胞术检测5-Aza-CdR及联合吉西他滨对Capan-2细胞的抑制率与凋亡率.应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR和Western blot的方法检测不同浓度5-Aza-CdR处理细胞前后PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 5-Aza-CdR能使胰腺癌细胞Capan-2增长速度减慢,呈浓度依赖性,联合吉西他滨显著抑制细胞生长;5-Aza-CdR联合吉西他滨与单药组、对照组相比,可显著诱导细胞凋亡.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞Capan-2的甲基化,恢复mRNA表达水平和蛋白表达水平,并呈一定的浓度正相关.结论 5-Aza-CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2的高甲基化状态,解除DNA高甲基化导致的基因沉默,重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达,同时可抑制胰腺癌细胞生长,与吉西他滨有协同抗肿瘤作用.     

血清ICTP与TRACP 5b联合检测在乳腺癌骨转移诊断中的价值

目的:探讨溶骨性骨代谢标志物血Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(ICTP)和血抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)的检测对诊断乳腺癌骨转移的价值.方法:用ELISA法测定78例乳腺癌患者及40例乳腺良性肿瘤患者血清ICTP和TRACP 5b水平,比较两者水平在骨转移、非骨转移乳腺癌患者及良性乳腺肿瘤患者中的差异及其相关性.结果:乳腺癌骨转移患者血清ICTP和TRACP 5b水平均明显高于无骨转移及乳腺良性肿瘤患者(均P＜0.001),而后两者间无统计学差异(均P＞0.05).乳腺癌患者血清ICTP与TRACP 5b浓度表达呈正相关(r=0.63,P＜0.01).血清ICTP和TRACP诊断乳腺癌骨转移的敏感性、特异性和准确性分别为55.3％,92.5％,81.4％和84.2％,83.8％,83.9％,两者联合检测分别为94.7％,81.3％,85.6％.结论:血清ICTP和TRACP 5b对乳腺癌骨转移的诊断均有重要价值,两者联合检测有助于提高诊断的敏感性和准确性.