鸡胚细胞的微载体培养

国外有许多利用微载体培养各种贴壁细胞的报道。鸡胚细胞(CEF cells)是最早用于体外培养的细胞之一,用它可生产多种鸡的疫苗,如法氏囊、新城疫、马立克疫苗等。我国生产上多采用滚瓶法,近年来才有微载体法培养的探索。要进行细胞的大规模培养,转瓶是有效的模拟,可以模拟生物反应器培养的一些条件,为放大作准备。本文模拟生物反应器的培养条件,用500ml转瓶（装液200ml）研究了鸡胚细胞在徽栽体上巾壁和生长的规律,为放大培养作了准备。     

微载体规模化培养细胞的研究

通过实验探索使用微载体进行动物细胞规模化培养,以期达到建立规模化生产病毒疫苗的目的。实验研究了Vero细胞的生长曲线,以及对细胞生长过程中影响细胞生长的葡萄糖、氨含量两个主要因素的变化规律以及微载体浓度与细胞密度的关系。通过实验发现微载体规模化培养细胞易于操作,比传统转瓶培养的细胞密度高,封闭式的培养方式不但减少了污染几率,而且可以充分保证疫苗的质量。最终找出适宜疫苗培养的微载体使用浓度为2.5g/L,适宜的细胞接种浓度为:1~5×105cell/m l。     

MDCK细胞微载体培养条件优化研究

研究细胞接种量、搅拌转速和微载体浓度对MDCK细胞微载体培养时的影响,以合理优化MDCK细胞微载体培养最大增殖时期的最优条件,对疫苗和病毒分离具有重要意义,以期达到在疫苗和病毒分离领域提高生产效率。采用微载体培养MDCK细胞,在不同搅拌转速、微载体浓度和细胞接种量进行培养,每隔24 h取样计数,确定最优的培养条件。结果表明,细胞接种量在20个/球、搅拌转速45 r/min和载体浓度在2 g/L时,MDCK细胞的增殖较快,细胞密度较大,细胞的密度最大可达15.6×106个/mL,适合MDCK细胞增殖生长。     

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Cytodex 1、Cy-todex 3、Biosilon、Bellco Glass Microcarrier、CT-1、CT-3、MC-1、CT-28种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Biosilon作为Vero细胞高密度培养的首选微载体。用500mlWheaton搅拌瓶探索影响Vero细胞高密度培养的条件,表明50～60mg/ml的微载体浓度、1～2×10⁶/ml的细胞接种密度、适当的通气(95％O_2+5％CO₂)对该细胞的高密度培养具有重要意义。在200ml培养体积的Wheaton搅拌瓶中,微载体浓度为50～60mg/ml,细胞接种密度为9.24×10⁵/ml,搅拌速度为65～85r/min,经25d培养,Vero细胞密度可达2.34×10⁷/ml,表明50～60mg/ml的微载体浓度对培养细胞没有毒性。接着在1.5L CelliGen生物反应器中进行培养,细胞接种密度为4.98×10⁵/ml,培养体积为1.2L,日灌流量从0.20L逐渐加大到3.65L,经22d连接灌流培养,最终细胞密度可达2.05×10⁷/ml。     

用多孔微载体大规模培养rCHO细胞

多孔微载体是近年来发展起来的一种用于大规模高密度培养动物细胞的支持物,具有许多优点,如：容易固定细胞,适合于贴壁细胞和悬浮细胞的固定化连续灌流培养;细胞生长在载体内部,增加了细胞固定化的稳定性,可降低血清用量,适合长期培养;能保护细胞免受机械损伤,增加搅拌强度和通气量,强化反应器的传质;比表面积大,为细胞提供了充分的生长空间;细胞固定化过程简单无害,细胞能从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体中生长,接种方便,操作简单。特别适合于搅拌式、气升式、周定床和流化床等生物反应器的大规模培养〔1,2。尿激酶原(pro-UK)是一种重要的溶栓药物．与一般的生物医药制品相比,pro-UK给药量较大(约20mg／人～80mg／人),小规模生产不能满足市场需求。本文报道利用20L搅拌式反应器培养分泌pro-UK的重组CHO细胞的工艺条件,取得了初步结果。     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备.通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基.发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清.利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×105 cells/ml.研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础.     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.     

Vero细胞微载体不同培养方法的评价

对三种不同培养方法进行细胞生长速度、密度、营养及代谢产物浓度的比较分析,以优化和筛选最佳培养条件与方式。用同体积生物反应罐,基本培养条件相同,采用批培养、再循环培养、灌流培养三种方式进行了Vero细胞微载体（CytodexI）的周期培养。三种培养方法均达到预期效果,最终细胞密度分别为每毫升2.09×10     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术。在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6~7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0~8.5logLD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到《中国生物制品规程》2000年版要求。实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107／mL,活细胞比率维持在90％以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×107／mL,活细胞比率维持在95％以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10％～20％,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100L上清中获得约80gu-PA(单链比例约为90％)。     

用微载体悬浮培养系统增殖细胞和病毒

我们用我院制备的MC-1型微载体成功地培养了BHK-13,BHK-21,和CHO-KI三株细胞。当微载体浓度为5mg/ml,细胞接种量为30×10~4细胞/ml左右时,一般在三天都可达到1×10~6细胞/ml。此时接种10~(-1)或10~(-2)的VSV,在37℃培养20-24小时,病毒产量可达到6LogTCTD_(50)/ml以上,其中以CHO-KI细胞的产量最高,它们与静止培养的细胞产量基本一致,也不亚于鸡胚细胞增殖的产量。目前用该系统增殖的VSV已用于IFN的研究工作中。实验的结果也表明,用该系统增殖其它病毒和制备疫苗,以及大量培养已引入重组IFN基因的CHO工程细胞也将是可行的。     

微载体培养Vero细胞精制狂犬病疫苗的研究

自本世纪70年代狂犬病二倍体疫苗研制成功并批量应用以来,各种细胞疫苗相继研制成功并投入生产和应用,已在许多国家代替了传统的脑组织疫苗。我们对Vero细胞微载体培养的狂犬病疫苗作了初步研究,为大规模生产提供依据。1材料与试剂1．IVere细胞由中国药品生物制品检定所提供Vero细胞125代种子细胞。1．2病毒株狂犬病毒Vero细胞适应株CTN＊。由检定所提供,毒力为7．lfogLfy。／Inl。我们对病毒株进行了适应性传代,毒力达到8．24logLfy。／Inl,高于国内发表材料4aG．Fluav．Inp株［’,到的满度。1．3生物反应器CeligenplusN哪沿…     

微载体上MRC-5细胞扩大培养的研究

通过研究摸索微载体上人二倍体细胞mrc-5的扩大培养,以期达到规模化生产病毒性疫苗的目的。本文对mrc-5细胞在微载体上的持续放大提出了一种新的思路,即"球转球",这就是将微载体上长满的mrc-5细胞全部消化下来,制备成细胞悬液,按照合适的比例转入到新的微载体上继续扩大培养。     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL,活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×10⁷/mL,活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。     

恒河猴脾肾细胞中的ANP样物质

用兔抗人α-心房利钠多肽(atrial natriure-tic peptide,ANP)血清和PAP免疫组织化学方法,观察到恒河猴脾白髓和肾髓质上皮细胞中存在ANP样免疫活性物质,其棕色颗粒,主要分布于细胞核周质内。猴脾提取物经Seph-adex G-15分离,可得到具有降压、利尿、利钠的组分,这些活性多肽的结构和功能需待进一步研究。     

用微载体技术培养家蚕BmN细胞的实验研究

观察了家蚕BmN(从silkworm Bombyxmori获得的细胞系)细胞在微载体cytodex3上的贴壁分布,提出其分布符合Poisson规律．并由此估计了不同细胞接种浓度时裸球的百分比．与实际观测结果基本符合;研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,家蚕BmN细胞在Cytodex 3上生长的临界接种数为一珠粒6．4个细胞。当微载体浓度为3 g／L时,最低的接种浓度为1．O×10⁵／ml。     

VerO细胞在气升式反应器中的微载体培养

哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的一种主要方法之－⑴。很多有工业价值的动物细胞都是贴壁细胞,必须附着在一定的表面上才能生长,微载体培养是一种有效的体系⑵。用于微载体培养的反应器多为搅拌式反应器,近年来,流化床式反应器越来越引起生化工程学家的重视。有希望用于大规模动物细胞培养的主要是液升和气升式。液升式反应器的优点是培养液可以间接氧饱和,气泡和细胞不直接接触。在气升式流态反应器中,气泡与细胞直接接触,其优点是操作方便,设备筒单。本文报道通过气升流态化反应器实现高密度贴壁细胞培养工艺条件的研究。     

高密度培养细胞的载体

麒麟啤酒与酒伊工程技术公司共同开发特殊加工纤维素的海绵,作为培养动物细胞的载体.待载体的工业生产设备在福井完成,即可在明年春天销售这种载体.商品名为"Cellsnow".两公司正在寻找代销店.预定价格比现有竞争品低.实用化细胞接合肽RGD"Cellsnow"是0.5～5mm见方的立方体.上面有很多孔径在100μm以上的小孔,细胞在孔内增殖.为适应动物细胞特征,必须最恰当地选择载体,适于修饰动物细胞附着的表面有3种,目的是提高载体对动物细胞的附着性.其中第三种表面对利用细胞接合蛋白     

微载体培养技术的研究进展

本文对近年来广泛用于动物细胞培养的微载体技术的特点，培养过程的优化作了详细的评述。