忍冬木层孔菌多糖的提取工艺优化及其体外抗氧化活性研究

忍冬木层孔菌(Phellinus lonicerinus(Bond.) Bond.et Sing)为湖北等地习用的桑黄品种,也是土家族常用药,多糖是其主要活性成分。为了研究忍冬木层孔菌子实体多糖(Phellinus lonicerinus polysaccharide, PLP)的提取工艺及其体外抗氧化活性,采用冷凝回流提取法在单因素实验结果的基础上,进行Box-Behnken响应面分析,确定PLP的最佳提取工艺,并通过测定忍冬木层孔菌多糖(PLP30、PLP60、PLP85、PLPA1和PLPA2)的还原能力、对DPPH、ABTS、羟基自由基的清除能力、对酪氨酸酶活性的抑制能力。结果显示PLP最佳提取工艺的参数为：料液比1∶20 g/mL、提取时间120 min、提取温度100℃,此条件下PLP提取率为(3.16±0.05)%;五种多糖对DPPH、ABTS和羟基自由基均具有较强的清除作用,且具有较强的还原力,其对ABTS自由基清除作用和还原力均与浓度呈量效关系。表明忍冬木层孔菌子实体多糖具有良好的体外抗氧化和一定的酪氨酸酶活性抑制能力。     

6种“桑黄”石油醚提取物的体内抗肿瘤活性

对6种＂桑黄＂的石油醚提取物进行了抗肿瘤体内试验,测定其对H22荷瘤小鼠抑瘤率、免疫器官指数、免疫因子含量和生存率的影响。试验结果表明：粗毛纤孔菌、鲍姆木层孔菌、火木层孔菌和瓦宁木层孔菌的石油醚提取物高、低剂量（100,50 mg/kg）以及黑壳目层孔菌石油醚提取物高剂量（100 mg/kg）对肿瘤均具有一定抑制作用,抑瘤率均〉40%;瓦宁木层孔菌石油醚提取物低剂量组（50 mg/kg）的抑瘤效果最佳,为76.82%,其脾指数、胸腺指数均明显高于阳性组（P〈0.01）,IL 2的含量也明显高于对照组和阳性组,能延长小鼠的生存期;椭圆嗜蓝孢孔菌石油醚提取物也具有一定的抑瘤效果,高、低剂量（100,50 mg/kg）抑瘤率分别为39.30%和36.17%。     

层孔菌属真菌抗氧化活性物质测定及抗氧化能力分析

本文以层孔菌属真菌液体发酵产物作为研究材料,测定抗氧化活性物质含量,并利用多种抗氧化测定方法,分析不同菌株的体外抗氧化能力,评价活性物质含量间、抗氧化方法间及抗氧化方法与含量间的相关性。研究结果表明,供试菌株活性物质含量间的差异较大,其中菌株H2粗多糖和总酚含量较高,菌株S黄酮含量较高,且活性物质含量间相关性不大;针对供试菌株抗氧化能力测定结果表明,菌株H2具有较高的还原力、铁离子螯合能力,菌株H2和H9的羟自由基清除作用最强,菌株H2和L的DPPH自由基清除作用最强,菌株H2、H5、H8、H9具有较高的超氧自由基清除作用,且不同方法间存在较大差异,羟自由基与DPPH自由基、铁离子螯合能力及还原力,DPPH自由基与铁离子螯合能力和还原力,以及铁离子螯合能力与还原力这几种方法的相关性较高(P0.01);总酚含量与羟自由基、DPPH自由基、铁离子螯合能力及还原力方法具有较高的相关性(P0.01);总黄酮含量与DPPH自由基、铁离子螯合能力及还原力方法间相关系数分别为0.810(P0.01)、0.725、0.738(P0.05);粗多糖含量与各测定方法间的相关系数较低,以上结果说明多酚类物质和黄酮类物质是抗氧化作用的重要因子,对抗氧化能力具有重要贡献。     

液体培养条件下槐生多年卧孔菌、微酸多年卧孔菌和白蜡多年卧孔菌的抗氧化活性研究

槐生多年卧孔菌Perenniporia robiniophila、微酸多年卧孔菌Perenniporia subacida和白蜡多年卧孔菌Perenniporia fraxinea均属于药用真菌,具有较高的应用价值。本研究将这3种药用真菌进行液体培养,测定此过程中的漆酶活性、多酚含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T‐AOC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性、抑制羟自由基能力(restraining ability to hydroxyl free radicals,RAHFR)和1,1‐二苯基‐2‐三硝基苯肼(1,1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力。结果显示,所选取的3种多年卧孔菌均具有抗氧化活性,且该活性与菌株自身的生长状况、次级代谢产物分泌及降解酶活性等密切相关。其中,微酸多年卧孔菌分泌的漆酶活性最高,出现峰值时间最早,第6天时酶活可达2.51U/m L。槐生多年卧孔菌在液体培养过程中分泌多酚、T‐AOC和CAT的能力最强,于第2天、第12天和第8天时分别达1.54mg/m L、2.59U/m L和7.71U/m L。此外,该菌株对羟自由基及DPPH自由基的清除能力也较强,在第10天和第2天分别为78.42U/m L和26.65%。而白蜡多年卧孔菌仅分泌SOD的能力最强,第2天时酶活为1.87U/m L。相比之下,3种多年卧孔菌中尤其以槐生多年卧孔菌的抗氧化活性最高,微酸多年卧孔菌次之,最后是白蜡多年卧孔菌。     

桦褐孔菌发酵及其提取物清除自由基活性的研究

用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)酶标仪法,对桦褐孔菌发酵液的甲醇提取物的自由基清除率进行了测定,发现该提取物具有较强的清除自由基的活性;进一步用DPPH薄层试验,结果发现该菌的CHCL3提取物中主要含有两个具清除自由基活性的组分.在此基础上,以清除自由基活性为指标,对桦褐孔菌液体发酵条件进行优化,发现当培养条件为:葡萄糖20g/L、甘油6mL/L、蛋白胨15g/L、CuSO4 0.005g/L、酪氨酸0.05g/L;种龄为7d、装液量为50mL/250mL、转速为180r/min、接种量为10%时,桦褐孔菌发酵液提取物的清除自由基活性最强.     

中国木层孔菌属三个新记录种

报道了木层孔菌属Phellinus 3个中国新记录种。赤杨木层孔菌Phellinus alni典型特征为菌盖具有较宽的同心环带和清晰的密集环纹菌核;黑木层孔菌P. nigricans具有较大的担孢子;东方木层孔菌P. orienticus具有平伏的子实体,担孢子相对较小。对这3个种进行了详细的描述和显微结构绘图。     

鲍姆木层孔菌子实体中化合物的结构鉴定及其抗肿瘤活性

鲍姆木层孔菌(Phellinus baumii)俗称桑黄菇,桑耳,是近年来开发的一种多年生药用真菌。已经有研究证实,桑黄具有降血糖,抗氧化,抗肿瘤等生物活性。该研究从化学成分的分离纯化和结构鉴定入手,寻找鲍姆木层孔菌子实体中具有抗肿瘤活性的化合物,为桑黄保健品的开发提供研究基础。采用色谱柱层析法,从鲍姆木层孔菌子实体中分离得到6个化合物,通过波谱分析,分别鉴定为Ergosta-7,22-diene-3β-ylpentadecanoate,Stellasterol,Ganoderol B,Ergos-t6,22-diene-3β,5α,8α-triol,Ganoderic acid DM,Inoscavin A。体外试验结果表明:化合物GanoderolB和Inoscavin A对肿瘤细胞HepG2的增殖均有抑制作用。其中,化合物Inoscavin A的抑制作用较强,其抑制肿瘤细胞增殖的IC50值为72.3μg/mL(156.4μmol/L)。     

煤绒菌原质团和菌核甲醇提取物抗氧化活性的研究

为探索黏菌的抗氧化活性,以总还原力、DPPH自由基清除率及O2自由基清除率为指标,首次对煤绒菌原质团和菌核甲醇提取物进行抗氧化活性研究。结果表明:煤绒菌原质团和菌核甲醇提取物均有较好的抗氧化活性,当质量浓度为0.8 mg/mL时,二者对O2自由基的清除能力最强,清除率分别为70.39%和86.83%;当质量浓度为0.4 mg/mL时,二者对DPPH自由基的清除能力最强,清除率分别为57.22%和62.91%,通过比较IC50值,菌核粗提物的抗氧化能力略优于原质团。     

瓦宁木层孔菌中多酚和黄酮类成分分离及清除自由基活性的研究

采用硅胶和反相C18柱层析方法,首次从瓦宁木层孔菌中分离得到了5个化合物,运用NMR波谱法分析和鉴定为樱花亭、7-甲氧基二氢莰非素、二氢莰非素、4-(3,4-二羟苯基)-3-丁烯-2-酮、hispolon。并通过建立体外二苯基苦味酰基苯肼自由基（·DPPH）、超氧阴离子自由基（·O2?）以及羟自由基（·OH）发生体系,研究了5个化合物对·DPPH、·OH和·O2?的清除作用。结果表明当浓度达到100μg/mL时,化合物4-(3,4-二羟苯基)-3-丁烯-2-酮和hispolon对·DPPH清除率分别为92%和93%,对·OH的清除率分别为90%和95%,而对·O2?的清除率分别为70%和77%,略低于清除·DPPH和·OH的能力;二氢莰非素对·O2?自由基的清除率为39%,强于清除·OH和·DPPH的能力;而樱花亭和7-甲氧基二氢莰非素对3种自由基的清除率均低于30%。2个多酚类化合物清除自由基的能力均强于3个黄酮类化合物。5个化合物清除自由基能力均表现出一定的浓度依赖性。     

“桑黄”的本草考证

对“桑黄”的古代、现代名称及其药用功效等方面做了全面考证.“桑黄”最早在汉代的《神农本草经》中记载为“桑耳”,在唐代甄权的《药性论》中才首次出现“桑黄”两字.认为中国“桑黄”,在分类上属于真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、绣革孔菌目Hymenochaetales、绣革孔菌科Hymenochaetaceae,主要包括来自Phellinus、Inonotus及Fomitiporia等属的具有显著抗肿瘤活性的木腐菌子实体,包括火木层孔菌Phellinus igniarius、瓦尼木层孔菌Phellinus vaninii、鲍姆木层孔菌Phellinus baumii、椭圆嗜蓝孢孔菌Fomitiporia ellipsoidea及粗毛纤孔菌Inonotus hispidus等的子实体,并具有明显的地域特色.     

碱提水溶针裂蹄多糖R1的研究

从针裂蹄中用０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ提取得到一种水溶多糖Ｒ１,用超离心法、琼脂糖４Ｂ柱层析法证明Ｒ１为均一多糖;用气相色谱法证明Ｒ１为甘露聚糖,用红外光谱,气－质联用,高碘酸氧化,Ｓｍｉｔｈ降解,甲基化等方法证明Ｒ１,结构是主链１－６甘露糖,侧链１－３连接的葡萄糖。     

白腐真菌SYBC-L2漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用

经过硫酸铵分级盐析、DEAE-cellulose离子交换层析、SephacrylTMS-200柱层析,从白腐菌株Phellinus sp. SYBC-L2所产的漆酶中纯化得到电泳纯漆酶Lac3,其纯化倍数为28.27,回收率为14.76%.Lac3为一种糖蛋白,糖含量29.66%,SDS-PAGE表观分子量约为64.3 kD;其催化氧化DMP(2,6-Dimethoxyphenol)的表观Km值和Vmax分别为1.01 mmol/L和186.2 U/mg蛋白.Lac3的最适温度为60℃,最适pH为3.5;在30℃～50℃和pH 4.5～9.0范围内稳定.Cu2+、SO42-、CO32-对Lac3具有一定促进作用,而Fe3+、Fe2+、NO3-则具有抑制作用.色素的最佳脱色条件为(Lac3终浓度为2 U/ml):媒介元PV在温度50 ℃、pH值3.0的条件下反应2 h,脱色率可达95.10%;弱酸蓝在温度40 ℃、pH值4.0的条件下作用3 h,脱色率为75.09%.     

桑黄真菌分子鉴定及遗传多样性分析

药用真菌桑黄具有明显的抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等药理活性,但研究者对其基源还没有达成共识,多种Phellinus属真菌被当作桑黄入药使用。采用rDNA ITS序列分析技术,对桑黄真菌进行分子鉴定及遗传多样性分析。通过rDNA ITS序列分析,成功鉴定出一份混淆样品(Phellinus spp-04),并将中国主要使用的桑黄真菌明确鉴定为P.baumii和P.linteus两种,未检测到P.igniarius的使用。依据rDNA ITS序列计算遗传距离并构建系统发育树,结果表明3种主要桑黄真菌存在明显的遗传分化,在系统发育树中明确聚为3个独立菌种类群。在3种桑黄真菌rDNA ITS序列中,存在颠换、转换及插入/缺失3种类型的变异位点,分别在P.linteus、P.baumii和P.igniarius中鉴定出9、9、8种rDNA ITS单倍型序列,不同单倍型菌种间遗传分歧度变化表现出明显的物种差异性。     

7种木层孔菌属真菌的培养特性*

描述了7种木层孔菌属 (Phellinus) 真菌的培养特性。它们是淡黄木层孔菌（P. gilvus）,火木层孔菌（P. igniarius）,裂蹄木层孔菌（P. linteus）,松木层孔菌（P. pini）,冷杉木层孔菌(P. pini var.abietis),苹果木层孔菌 (P. pomaceus) 和稀硬木层孔菌（P.robustus）。     

桑黄发酵液中凝集素SHL24的分离与生物活性研究

【背景】桑黄是一种具有很高药用价值及广泛应用前景的药用真菌,其主要有效成分为多糖。凝集素则是桑黄所含的另一类生物活性物质,具有免疫调节、抗肿瘤及抗菌等作用。【目的】从药用真菌桑黄发酵液中分离纯化凝集素SHL24,并对其生物活性进行初步探究。【方法】通过冷冻干燥、Sephadex G-50、DEAE Sephadex A-25、MPLC-MonoQ和LPLC-Sephadex G-75等方法,从药用真菌桑黄的发酵液中进行分离纯化;利用LPLC-Sephadex G-75和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其分子质量;检测不同pH、金属离子、糖、发酵时间、血红细胞、温度对其凝血活性的影响。【结果】从药用真菌桑黄发酵液中分离到单一蛋白条带,SDS-PAGE凝胶电泳检测其分子质量约为24 kD,与分子筛层析法分析的分子质量一致,表明该凝集素为单亚基蛋白。SHL24可以凝集供试的小鼠血红细胞和4种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集程度不同。糖抑制试验表明,SHL24不被D-甘露糖、D-麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、树胶醛糖、D-乳糖以及L-鼠李糖所抑制。热稳定性试验和金属离子对SHL24凝血活性影响试验表明SHL24具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)等二价阳离子的影响。【结论】SHL24具有的稳定理化性质和生物活性,有作为蛋白质药物的潜质。     

桑黄菌丝体粗多糖的提取方法研究

采用正交试验设计,以桑黄菌丝体粗多糖含量为考察指标,用苯酚—硫酸法,分别确定了热水浸提法、微波辅助提取法和超声提取法的最佳工艺。通过极差分析得出:热水浸提法的最优工艺为浸提时间3 h、浸提3次、液料质量比50∶1、浸提温度90℃,粗多糖提取率为2.10%;微波提取法的最优工艺为微波处理15 min、液料质量比50∶1、提取3次,提取率为4.18%;超声提取法的最优工艺为超声30 min、提取2次、液料质量比60∶1、温度60℃、频率60 Hz,提取率为3.02%。微波辅助法与热水浸提法相比,时间缩短,且提取率提高近1倍;与超声提取法相比,时间缩短1/2,但提取率提高40%。因此,微波辅助提取法速度更快、提取效率更高、操作更简便,优于其他2种方法。     

桑黄粗多糖除蛋白及抗肿瘤活性

旨在研究Sevag法除桑黄粗多糖中蛋白的最佳工艺,并通过噻唑蓝(MTT)细胞比色法测定除蛋白前后桑黄多糖的抗肿瘤活性。在单因素试验Sevag用量、氯仿与正丁醇体积比、萃取次数、震荡时间的基础上,设计正交试验,经过方差分析,确定Sevag法除桑黄粗多糖蛋白的最佳方案;并且对除蛋白后多糖与粗多糖进行体外抗肿瘤实验。Sevag法除桑黄粗多糖蛋白的最佳工艺:Sevag用量50 mL、V(氯仿)/V(正丁醇)=3、最佳萃取次数6次、最佳振荡时间20 min,在此条件下,多糖的得率为64.8%。体外细胞试验表明除蛋白后多糖与粗多糖对肿瘤细胞EC109和SiHa的抑制率没有明显差异。     

水溶性phellinus多糖PS1的分离提取及免疫活性研究

目的：从Phellinus pini子实体中提取分离到一种水溶性多糖纽分PS1,并对其免疫活性进行初步研究。方法：先进行热水提取,DEAE-纤维素离子交换树脂,sepharose CL-4B凝胶树脂分离纯化PS1,并利用GC色谱、FT-1R光谱进行组成成分分析,然后通过刚果红吞噬实验、脾脏B淋巴细胞增殖实验及免疫器官指数评价其免疫活性。结果：PS1为一种β型杂多糖,总糖含量70．36％,蛋白质含量4．69％,分子量为230kDa。糖类构成有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖,其摩尔比为2．14：2．36：0．44：4．28：5．17：85,61。多糖PS1能显著提高正常小鼠的脾指数和胸腺指数（P〈0．01）,免疫力低下小鼠的肝指数、胸腺指数也有提高,但效果不明显．PS1均能提高正常和免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬能力。此外。PS1能显著促进脾细胞体外增殖能力（P〈0．01）。结论：多糖PS1能显著提高机体的免疫能力。可作为一种生物效应调节剂应用于医药或保健食品领域。     

Structure of polysaccharides from mycelium and culture medium of Phellinus nigricans using submerged fermentation

Two water-soluble polysaccharides, PNW1 and PNM1, were respectively isolated from the mycelium and its culture medium of Phellinus nigricans using submerged fermentation before determining their effects on inhibiting the growth of transplantable tumors in mice. The results of the pharmaceutical experiments showed that oral administration of PNW1 and PNM1 (at a dose of 400 mg/kg) inhibited the growth of tumor of mice-transplanted Sarcoma 180 in vivo. Moreover, a higher inhibition ratio of PNW1 (74.70%) was obtained as compared with PNM1 (55.84%). The averaged molecular weight of PNW1 and PNM1 was determined to be 33 and 29 kD, respectively. Both PNW1 and PNM1 were consisted of glu- cose, galactose, mannose, arabinose and fucose. The major structural features of PNW1 and PNM1 were elucidated using partial acid hydrolysis, periodate oxidation, Smith degradation, 13C-NMR, me- thylation and GC-MS. On the basis of these results, the repeating units of PNW1 and PNM1 were estab- lished.